饲料中霉菌毒素检测技术研究进展

邓惠中 贺建华

霉菌毒素普遍存在于饲料以及饲料原料中，据美国食品和药物管理局的调查表明全球25%的饲料及饲料原料受到霉菌毒素的污染。饲料中霉菌毒素影响动物的健康和生产性能，如动物对霉变饲料中养分的利用率显著下降；因采食霉变饲料而诱发的多种动物疾病；影响饲料适口性；产毒霉菌和致病细菌等存在的几率大大提升[1-2]。饲料中霉菌毒素对动物的影响通过食物链传递到食品安全[3]，同时对人类健康也产生了威胁，所以必须对饲料及原料中霉菌毒素水平进行实时监控。本文对饲料中霉菌毒素常规检测技术作了简要综述，并总结了霉菌毒素检测技术近十年的发展，为霉菌毒素的检测工作提供科学参考。

1 霉菌毒素检测的样品处理

在霉菌毒素检测的取样、制样和分析中都客观的存在一定误差。由于真菌毒素的污染是极不均匀的，在农产品中的存在“10-9”水平，所以取样环节产生的误差最大，约占总误差的85%以上，而制样与分析两个环节共占总误差的15%以下[4]。采样要注意代表性并防止污染，准备灭菌容器和工具，详细记录样品相关信息，低温干燥保存，及时检测[5]。原始样品必须粉碎后进行二次取样，粉碎粒度越小，样品均匀度越好。如果样品粉碎粒度不佳，可以将粉碎样品放入搅拌机中加入适量溶剂（水或庚烷）搅拌成泥浆状[6]。霉菌毒素的提取常用的提取溶剂，如：甲醇、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈和水的混合物[7]。定性分析还需对提取液中的霉菌毒素进行分离。

2 常规霉菌毒素分析测定技术

霉菌毒素的分析测定不仅要考虑精确度，还要考虑分析的速度、成本以及分析能否提供定性或者定量的结果。分析测定应该根据分析目的以及实际情况选取快速、简单和定量的方法。

2.1 薄层色谱测定法(Thin Layer Chromatography,TLC)

薄层色谱测定法(TLC)是最早建立的一种检测方法，具有简便、经济、对设备和检验人员要求不高等特点。此法的原理是针对不同的样品，使用适宜的提取溶剂将霉菌毒素从样品中提取出来,经柱层析净化,再在薄层板上层析展开、分离,利用霉菌毒素的荧光性,根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量。大麦和咖啡豆中赭曲霉毒素A的TLC检测方法分别在1973年和1975年首次通过,成为国际分析化学家协会(Association of Analytical Communities,AOAC)的官方方法，1988年成为法定方法[8]。1991年，我国卫生部食品卫生监督检验所等单位建立了谷物和大豆中赭曲霉毒素A的TLC分析方法。现国家标准方法仍采用此法检测小麦、玉米、大豆中赭曲霉毒素A的含量，检测下限为 10 μg/kg[9]。

2.2 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)

高效液相色谱方法(HPLC)在20世纪60年代开始使用，近几年来在各个行业的发展迅速。HPLC法是定量分析真菌毒素的常规方法，其原理是在适宜的流动相条件下，采用固相萃取柱，使多种霉菌毒素同时分离进行检测后再通过测量色谱峰的面积计算含量。该方法的优点是特异性强、灵敏度高、定量准确，可同时分离多种霉菌毒素，操作也简便，适于大批量样品的分析。据报道用HPLC法检测食品中黄曲霉毒素，分离效果好，重复性强，最低检出限达到10-12级水平，回收率在92.61%～99.25%[10]。检测谷物中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素，检测限分别为0.24、4.0和0.5 mg/kg[11]。但此方法的仪器价格昂贵，前处理繁琐，方法的建立复杂，操作的技术难度大，短时间内难以广泛应用。

2.3 气相色谱法(Gas Chromatography GC)

1986年AOAC就将气相色谱法(GC)引入到小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法中,检测限为350 ng/g。现气相色谱法主要用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇的定量检测。GC具有灵敏、高选择性、准确性和精确性等优点。但也存在如下问题：标准曲线线性关系不佳、样品进样的滞留、记忆效应以及基质干扰的存在[12]。GC不及液相色谱法快速,检测费昂贵,技术和操作要求也高,所以在霉菌毒素检测方面的应用较少。

2.4 酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA)

酶联免疫吸附测定法（ELISA）20世纪70年代初提出，80年代引入国内应用于各种生物化学物质的免疫测定，是检验乙肝、丙肝、艾滋病抗体的主要方法。此法操作简便，灵敏度高，能进行定量分析，特异性强，试剂保存时间长，对环境污染小，目前已经拓展到食品、饲料、肉类等行业。多个国家卫生标准中霉菌毒素的检测方法中都包含此方法，如粮食、发酵酒、发酵性豆制品、淀粉类制品、花生油和其他食用植物油、色拉油、酱油、酱、食醋、婴幼儿配方乳粉Ⅱ、Ⅲ[13-22]等。现在建立在酶联免疫吸附测定法基础上研发的商业化的试剂盒能在短时间内进行大量样品的分析，检测成本相对较低，检测限达1 ng/kg，能符合欧盟的检测要求。但酶联免疫吸附测定法存在假阳性的情况，需要进一步的研究来完善此方法。

3 霉菌毒素检测技术的发展

随着分析检测技术的飞速发展以及生物技术的引入使得霉菌毒素检测技术近年来发展迅速，一些新技术已经应用于实践之中。

3.1 时间分辨荧光免疫分析 (Time Resolved Fluoroimmunoassay TRFIA)

时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)属于超微量检测领域中一项新兴的检测技术，由Pettersson等人于上世纪八十年代创立。原理是以荧光强度高且衰变时间长的三价稀土离子为标志物来延缓测量时间，等样品中短寿命的自然荧光衰变后再测稀土离子的荧光，可消除自然荧光的干扰。据报道黄曲霉毒素B1的高灵敏时间分辨荧光免疫分析法的灵敏度为0.01 μg/l，检测范围0.01～100 μg/l,批内和批间变异分别为4.1%和6.8%，平均回收率为97.2%[23]。TRFIA的荧光计数可以跨越4个数量级,可测范围可以达到0.01～100 μg/l，既可以满足低浓度的限量要求，也可以满足较宽范围的定量检测要求，是一种简便、快速、经济的可进行大批量样品筛查的方法[24]。

3.2 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)

聚合酶链式反应（PCR）是近年来在分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的技术。PCR技术的基本原理是应用细菌遗传物质中各菌属菌种高度保守的核酸序列，设计出相关引物，对提取到的细菌核酸片段进行扩增，进而用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果[25]。刘秀梅以伏马毒素合成酶基因为基础，设计了3对引物,建立了伏马菌素产毒菌株PCR鉴定技术,32株分离菌株的伏马菌产毒基因测定结果与生物合成毒素的HPLC测定结果符合率良好，同时明确了产毒菌株和非产毒菌株在核苷酸序列上的差异[26]。据报道，有研究者通过PCR法检测棒曲霉毒素合成簇上的一个关键的脱青霉基因作为毒素是否产生的指标，经过HPLC法验证后表明，其与HPLC法的相关性良好[27]。此法简便快速，但并不完善。需要对毒素合成机理进行详细分析,检测体系也需要实践验证,比如有些黄曲霉菌株含有黄曲霉毒素合成基因,但并不产生毒素[28]。

3.3 生物传感器(Biosensor)

1967年S.J.乌普迪克等研制出第一个生物传感器（葡萄糖传感器）。生物传感器是将生物技术和电子技术相结合的，以生物学组件作为主要功能性元件，能够感受一定范围内的被测量，并按照一定规律将其转换成可识别信号的器件或装置，包括利用酶的特性的催化型生物传感器(酶传感器和微生物传感器等)和利用分子间特异的亲和性的亲和型生物传感器(免疫传感器和DNA传感器等)。生物传感器是开发快速检测霉菌毒素的有效技术，通过光纤免疫传感器来测定花生和玉米抽提物中的黄曲霉毒素B1，检测限可达0.05 ng/ml[29]。一些研究初步探索了酶生物传感器三电极系统对杂色曲霉素(ST)的电化学分析[30]，检测下限为 8.32×10-5mg/ml，响应时间 10 s。Arduini F 研究发现黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2和 M1)可以抑制乙酰胆碱质酶的活性。根据这一特性，在设定乙酰胆碱质酶的浓度、反应时间的前提下，乙酰胆碱质酶的活性下降和黄曲霉毒素的浓度(10～60 ng/ml)成正比，并且该操作在3 min之内就可完成，该方法进一步完善后能应用于黄曲霉毒素的检测[31]。

4 霉菌毒素检测技术未来发展方向

霉菌毒素快速检测方法的研发，要求在30 min内（包含样品制备的时间在内）或5 min内（不包含样品制备的时间）完成快速检测。金标试纸法在进行测定样品时无需大型检测仪器和加入任何试剂，不需接触标准品，方法简便快捷，15 min内即可得到结果，实现了一步法检测[32]。应用竞争抑制免疫层析的方法,研制了快速检测赭曲霉毒素A的胶体金试纸条,检测限为 10 ng/ml，有效检测范围 0～100000 ng/ml，检测时间10 min[33]。2009年6月，由中国农业科学院饲料所信息中心主办的“首届饲料企业霉菌毒素检测技术暨饲料防霉应用技术培训班”大力推广介绍了霉菌毒素金标试纸法快速检测方法。在质量保证和风险管理的层次，需要做到在关键点监测污染的食物链；查明和监测故障的产品和“隐蔽”毒素，改善和发展定性检测。利用分子检测系统来检测全球的赭曲霉毒素A和黄曲霉产物种类以避免贸易壁垒的产生。利用基因组学开发特殊的标记基因来检测特殊的产毒真菌种群，为霉菌毒素风险评估和预测新产毒真菌种群提供有效的科学基础。

5 小结

饲料中霉菌毒素检测与人类以及动物的健康和生产密切相关，因此研发有效、低成本、快速的检测手段尤为重要。霉菌毒素的检测应该发展为绿色检测技术，现有的检测技术大多要以霉菌毒素标准品来建立标准曲线，而霉菌毒素标准品的毒性非常强，这样对检测的安全带来了很大隐患。检测过程中的提纯和分离需要用到大量的极性强的有机溶剂，这些溶剂对环境污染很大，必须进行回收。今后霉菌毒素检测研究的重点方面在于实验室工作人员无害的分析方法；各种产品和真菌毒素包括采样计划在内的分析技术标准的建立；高灵敏、高特异性、绿色、节能、快速和便捷的检测方法及检测仪器的开发。

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