副猪嗜血杆菌病的诊断与防治

郑其升，何家惠，侯继波

（江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京 210014）

副猪嗜血杆菌（HPS）是猪上呼吸道正常菌群中的一种常见细菌，但在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病。本病通过直接接触、呼吸道及消化道等途径传播，以5～8周龄的仔猪最易感，其他年龄段的青年猪、母猪及种公猪亦可感染，有的以隐性感染或慢性跛行为重。近几年来，我国副猪嗜血杆菌在养猪场引起猪多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，特别是规模化猪场在受到蓝耳病、圆环病毒等感染之后猪群免疫功能下降时，副猪嗜血杆菌病伺机暴发，导致较严重的经济损失。为了加强对该病的防治，笔者对本病的诊断防治研究综述如下。

一、流行病学

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在菌，能从健康动物的鼻腔、鼻气管分泌物和扁桃体中分离到。副猪嗜血杆菌只感染猪，有很强的宿主特异性。病菌寄居于感染猪的呼吸道，在应激情况下各年龄猪群都易发病，饲养环境不良、断奶、转群、混群或运输也是常见诱因。因此，自1910年Glasser报道以来，本病成为一种全世界广泛分布的疫病。

副猪嗜血杆菌病的主要传播途径是空气、猪与猪之间的接触或通过污染排泄物，病猪和带菌猪是本病的主要传染源，未免疫的猪场或特别健康的猪群(如SPF猪)最容易受到侵袭。首次感染本菌的猪症状可能很严重，已经免疫的猪只被感染时表现非典型症状。在肺炎中，副猪嗜血杆菌被假定为一种随机入侵的次要病原，是一种典型的“机会主义”病原，只在与其它病毒或细菌协同时引发疾病。该病常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒和猪呼吸道冠状病毒引起的病毒病及猪气喘病并发。研究表明PRRSV感染的猪肺中，副猪嗜血杆菌的检出率为50%左右，显示副猪嗜血杆菌病很可能是PRRSV感染后的二次性病原。

二、临床症状

本病急性病例往往先发生于膘情良好的猪，表现为发热（40.5℃～42.0℃）、病初贫血、呼吸困难、耳稍发紫、眼结膜发绀、眼睑皮下水肿，不喜运动，精神沉郁、食欲下降或不食，体表皮肤发红或苍白，行走缓慢或不愿站立，腕关节、跗关节肿大，共济失调，临死前侧卧或四肢呈划水样，有时也会无明显症状而突然死亡。

慢性病例多见于保育猪，主要表现为食欲下降、咳嗽、呼吸困难、被毛粗乱，四肢无力或跛行，生长不良，甚至衰竭而死亡。耐过的猪只常发展成慢性型。

三、病理变化

急性病例尸体剖检可见多发性纤维素性或浆液性、纤维素性浆膜炎和关节炎。主要表现为胸膜炎、腹膜炎、脑膜炎、心包炎、关节炎。多见纤维素性或浆液性渗出，胸水、腹水增多，有时肺脏发生粘连、肿胀、出血、瘀血。胸腔内有大量淡红色液体及纤维素性渗出物凝块；心包膜与心脏粘连，心包内常有干酪样甚至豆腐渣样渗出物，使心外膜与心脏粘连在一起，形成“绒毛心”，是本病最典型的病理变化，通常出现在病程较长的病例；肺脏出血，表面覆盖大量纤维素性渗出物并与胸壁粘连，多数为间质性肺炎，部分有对称性肉样变化，且有大量小化脓灶，外包有结缔组织；化脓性或纤维素性腹膜炎，腹腔积液或内脏器官粘连;全身淋巴结肿大，暗红色，切面呈大理石花纹；关节肿大，关节腔内有大量粘液性纤维蛋白渗出物，以跗、腕关节居多；肾、十二指肠均有出血点，回盲口附近有轮层扣状溃疡；脾出血性梗死。尤以心包炎和胸膜肺炎的发生率为最高。

慢性病例最特殊的病理变化是纤维性化脓性支气管肺炎，兼有纤维性胸膜炎。病灶往往出现在肺脏背部，呈圆形，有明显的界限。通常在肺的横膈膜叶较易出现病灶。早期组织学病变包括坏死、出血，嗜中性白细胞浸润，巨嗜细胞和血小板激活，血管内血栓形成；后期则主要以巨嗜细胞浸润为特征。

四、诊断

(一)细菌分离鉴定采集处于急性期病猪（在使用抗菌药物之前）受损浆膜面上的炎性物质如脑脊髓液，心包液及关节液等接种于含有NAD（烟酰胺酰嘌呤二核苷酸）的培养基，37℃恒温培养24～48 h后，可见一些小而透明的菌落；在鲜血琼脂培养基上培养没有溶血环；在显微镜下可见到单个的从球杆状到细长，甚至丝状等多种不同形态的菌体，通常具有荚膜；该菌革兰氏染色呈阴性；生化试验表明，该菌脲酶阴性，氧化酶阴性，可发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麦芽糖等，从以上试验结果基本可以诊断该菌为副猪嗜血杆菌。

细菌的分离鉴定对确诊是必要的，但往往不能成功，这是因为副猪嗜血杆菌十分娇嫩，相对于样品中可能同时存在的其它细菌，其生长需要难以满足，因此不能确认采集来的标本中究竟是否存在副猪嗜血杆菌。正因为如此，许多研究对分离鉴定诊断副猪嗜血杆菌病的方法进行了改进，归纳起来有以下几点：

首先，在同一猪群中出现副猪嗜血杆菌的几个菌株或血清型并非少见，甚至在单个猪的不同标本中也可发现不同的菌株或血清型，简单的分离鉴定难以确定引起致病的主要菌株，从全身各处或大损伤点的分离是唯一能保证所分离出来的细菌在病程中发挥作用的前提，细菌分离培养最好选择浆膜表面物质或渗出的脑脊髓液及心脏血液，即使病变轻微或不明显也要这样做。

其次，为了消除临床上抗菌素的使用对细菌分离的影响，采集病料时应当选择处于疾病急性期的猪并在应用抗菌素之前进行细菌的分离鉴定。

第三，由于副猪嗜血杆菌十分脆弱，放置时间过长的病料往往难以分离出副猪嗜血杆菌，因此病料可以在送到诊断实验室之前接种到转移培养基，再从这种液体培养基中获得副猪嗜血杆菌。

第四，可对分离方法以及培养方法进行改进: 如使用含抗菌素的选择性培养基，或运用特殊的稀释技术以提高副猪嗜血杆菌的分离率，用脱纤维蛋白鲜血和胰蛋白胨鲜血琼脂培养基可以提高生长速度。

(二)血清学检测补体结合试验、间接血凝试验及酶联免疫吸附试验已用于检测副猪嗜血杆菌的抗体。在急性病例的临床经过中，大约1周出现循环补体结合抗体，相同的特异性抗体滴度在攻毒后得到一致证实，但发现各种血清型之间具有交叉反应。Takahashi等在一项疫苗试验中采用了补体结合试验检测抗体滴度，在二免后19日观察到阳性的抗体滴度，但没有对交叉反应作出研究。对使用超声波破碎的细菌或煮沸的细菌作为包被抗原致敏绵羊红细胞建立的间接血凝试验的研究，以及对使用煮沸的细菌菌液上清或经过透析的热酚水提取物(脂多糖，LPS)作为包被抗原建立的ELISA的研究表明，这些诊断方法不稳定并且经常出现假阴性结果，甚至当免疫后的动物攻毒得到完全保护时也是如此，这些方法用于评估副猪嗜血杆菌的保护性免疫反应不可靠。Solnoa-Agullar采用福尔马林灭活的全细菌作为包被抗原用于EuSA检测并研究了疫苗免疫后的母源抗体滴度和仔猪的体液免疫反应，表明免疫母猪所产的仔猪早在5日龄即可检测出母源抗体。

近年来，IHA经过不断改进后已广泛应用于检测血清中各种病原的抗体，与ELISA相比，IHA操作过程简便、节省时间且不需要特殊仪器。将副猪嗜血杆菌经超声波破碎处理后的产物致敏醛化靴酸化红细胞，建立的检测副猪嗜血杆菌抗体的有效检测技术，采用该法对副猪嗜血杆菌15种血清型标准血清的检测结果都为阳性。对猪瘟、口蹄疫、圆环病毒、细小病毒、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、猪气喘病、猪链球菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪传染性萎缩性鼻炎及胸膜肺炎等病原的标准阳性血清的检测结果全为阴性，具有良好的特异性。

（三）分子生物学检测

1.PCR检测。根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物建立的PCR诊断方法可进一步提高从临床样品中检测副猪嗜血杆菌的灵敏性，其敏感性远远高于常规的细菌分离方法。该PCR方法主要应用于确定全身感染副猪嗜血杆菌在发病猪场的流行情况，通过无菌拭子采集的样品可在24 h内得出结果。PCR方法具有高度特异性，其最低检测量为102CFU/ml。以从猪器官中经常分离到的15种其它细菌抽提的DNA做模板时，结果全为阴性。但当以吲哚放线杆菌DNA作为模板时可以观察到一条弱带，由于吲哚放线杆菌主要出现于常规饲养猪的上呼吸道，因此，只有那些自全身性部位采集的样品用于PCR检测才具有诊断价值。目前，国外已有了几种检测HPS种特异性的PCR方法，并且开始研究用PCR方法鉴定某种血清型菌株，并积极完善和建立能直接检验临床样品的副猪嗜血杆菌种特异性和各地血清型特异性的PCR方法。

2.限制性片段长度多态性。现已建立一种聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）试验，作为副猪嗜血杆菌流行病学研究分型的另一种方法。以PCRRFLP法对编码转铁结合蛋白的基因htpA进行分析，从而对副猪嗜血杆菌进行分型，结果表明15种副猪嗜血杆菌标准菌株产生12种不同的图谱。这些标准菌株中，血清型5、12、14和15具有共同的酶切图谱。Rdeondo等对101株副猪嗜血杆菌现场分离株的分型表现出33种RFLP图谱，其中有10株细菌与标准菌株产生的图谱一致。用琼脂扩散试验对66个菌株进行血清型分型，发现其分属25种RFLP群，表明在相同的血清型内具有遗传多样性，而27株不能分型的菌株分属14种不同的RFLP群。血清型与RFLP之间没有相关性。

3.重复序列PCR。重复序列PCR已被用于描述副猪嗜血杆菌分离菌株的多样性以及副猪嗜血杆菌感染的流行病学研究。重复序列PCR的原理是：设计与散在的重复序列互补的外向寡核苷酸引物进行PCR，对这些重复序列之间相应的不同长短DNA序列进行扩增，产物经电泳后即可形成具有菌株特异性的DNA指纹图谱。这些散在的重复序列中，有相当多的重复序列保存在不同种属的细菌，因此同一对引物可应用于多种不同的细菌。由于不同细菌菌株重复序列之间的DNA序列长短不同，散在的重复序列探针和基因组指纹图谱可用于区分不同的细菌。

4.原位杂交。Jung等用原位杂交在自然感染猪检测副猪嗜血杆菌，在原位杂交中用非放射性的地高辛标记的DNA探针。他们选择了20头发病猪，用PCR扩增16S rRNA产生821bp的DNA片段作为探针，将组织（肺、心、脾和肝脏）用福尔马林固定石蜡包埋后检测杂交信号，发现鉴定含副猪嗜血杆菌的细胞有时比较困难，但观察HE染色的相邻部分可以确定阳性细胞，包括含副猪嗜血杆菌的巨噬细胞（大的卵圆形细胞核和丰富的细胞质）和嗜中性细胞（二分叶的细胞核），该法具有病理观察和病原检测的双重作用。

五、防制

严格消毒，搞好环境卫生做好环境消毒工作，以杀灭猪舍内的细菌和病毒，特别是与本病发生有极大关系的支原体、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒和猪呼吸道冠状病毒等。可用2%氢氧化钠水溶液喷洒猪圈地面和墙壁，2 h后用清水冲净，再用百毒速杀喷雾消毒，连续喷雾消毒4～5 d。

在饲养管理过程中实行严格的全进全出制，杜绝将各生产阶段的猪或不同来源的猪混群饲养。其次在疾病流行期间有条件的猪场仔猪断奶时可先分群饲养，再合群，对合群的一定要严格把关，把病猪集中隔离在同一猪舍。另外在饲养过程中注意保温和温差的变化。最后在猪群断奶、转群、混群或运输前后可在饮水中加一些抗应激的药物如维生素C等，同时在料中添加药物，并给以全价饲料、放在温暖、干燥、通风良好的猪舍内，给充足的饮水以防止该病的发生。

加强免疫接种，副猪嗜血杆菌现已确定有15种血清型，各型的致病力都不相同，因此选择疫苗时要注意所选疫苗菌株血清型是否与当地流行的菌株血清型一致。我国目前流行的副猪嗜血杆菌主要为血清4型和5型，免疫含有血清4型和5型的双价菌苗能显著降低血清13型和14型菌株感染后的病变程度和病死率(因为不同血清型之间存在一些共同抗原决定族，并可诱导产生交叉保护)。在副猪嗜血杆菌病严重的猪场，必要时可对猪群进行免疫。后备母猪产前40 d初免，产前20 d二免；经产猪产前30 d免疫1次即可。受本病严重威胁的猪场，小猪也要进行免疫，根据猪场发病日龄推断免疫时间，仔猪免疫一般安排在7日龄到30日龄内进行，1 ml/次，最好初免后过15 d再重复免疫1次，二免距发病时间要有10 d以上的间隔。

发病早期，抗生素的使用以降低死亡率和延迟发病，但是停药后本病将再度暴发，大量投药也会增加药物残留和产生抗药性的风险。在暴发严重的副猪嗜血杆菌病时，抗生素的使用价值不高。目前药敏试验表明该菌对磺胺甲基异氟甲砜霉素、头孢菌素、阿莫西林、氨苄青霉素、喹诺酮类、庆大霉素及增效磺胺，大多数菌株对红霉素、四环素、氨基苷类和林可霉素类有抵抗力。

六、展望

近年来，对副猪嗜血杆菌的病原学、血清学、分子生物学检测技术进行大量研究，已建立了副猪嗜血杆菌的快速分离鉴定方法，但许多重要的领域还有待于深入研究。确定和描述可能的毒力因子，阐述获得保护性免疫的机制，建立一种可以区分常在菌与全身性感染菌的血清学诊断方法，以及研制广谱的疫苗等都是对副猪嗜血杆菌的研究需要深入的重要领域。

（略）