HPLC法测定戊四硝酯粉及戊四硝酯片的有关物质

戊四硝酯粉及戊四硝酯片收载于《中国药典》2005年版二部，但现行国家药典标准中没有有关物质检查项。《英国药典》2007年版中也有收载，但在采用英国药典的方法进行试验时，有一杂质峰并不能完全与主峰分开，在对流动相的pH值进行调节后才能完全分离。因此，本方法主要是在英国药典的基础上进行了改进。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC-20AT泵，SIL-20AC自动进样器以及CBM-20A系统控制器，CTO-20A控温箱。

1.2 试药 戊四硝酯粉及戊四硝酯片由北京益民药业有限公司提供，戊四硝酯粉的批号为0803080，戊四硝酯片的批号为0 805060；辅料也由北京益民药业有限公司提供；甲醇为色谱纯，水为纯化水。

1.3 溶液配制

1.3.1 系统适用性试验溶液 称取硝酸甘油对照品溶液适量（相当于硝酸甘油20mg），置25ml量瓶中，加甲醇20ml超声15分钟，加流动相稀释至25ml，作为硝酸甘油对照品贮备液，精密量取硝酸甘油对照品贮备液1ml，以及供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，作为系统适用性试验溶液。

1.3.2 供试品溶液及对照溶液 精密称取戊四硝酯粉或戊四硝酯片适量（约相当于戊四硝酯25mg），加甲醇20ml超声15分钟，加流动相稀释至25ml，摇匀，滤过，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加流动相稀释至每1ml含6ηg的溶液，作为对照溶液。用二极管阵列检测器对供试品溶液的色谱峰纯度测定，主峰色谱峰纯度均为0.9999。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Phenomenix C18柱（5μm,150 mm×4.6 mm），用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（54：46）（用磷酸调节pH值至3.0）为流动相；检测波长为230 nm，进样体积10ηl。

2.2 系统适用性试验 取“1.3.1”项下的系统适用性试验溶液注入液相色谱仪。

2.3 辅料干扰试验 取辅料适量，照“2.1.2”项下配制，结果表明，辅料不干扰供试品溶液的测定。

2.4 专属性考察 取样品分别置紫外灯（254nm、365nm）放置4小时、60℃恒温烘箱以及RH92.5%的条件下放置，分别于10天取样，精密称取适量，照有关物质检查方法试验。在这些条件下，降解产物个数和含量略有增加，与主峰分离度均能符合要求，峰纯度均能达到0.9990，说明系统具有良好的专属性。①酸破坏试验。取本品适量（约相当于戊四硝酯50mg），置50ml量瓶中，加入1mol/L的盐酸溶液2ml，在60℃水浴中加热5分钟，放冷，加入1mol/L氢氧化钠溶液2ml，再加入甲醇30ml超声，加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。②碱破坏试验。取本品适量（约相当于戊四硝酯50mg），置50ml量瓶中，加入1mol/L氢氧化钠溶液2ml，在60℃水浴中加热5分钟，放冷，加入1mol/L 盐酸溶液2ml，再加入甲醇30ml超声，加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。③氧化破坏试验。取本品适量（约相当于戊四硝酯50mg），置50ml量瓶中，加入过氧化氢溶液湿润样品后，在60℃水浴中加热5分钟，放冷，再加入甲醇40ml超声，加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。在这些条件下，降解产物个数和含量略有增加，与主峰分离度均能符合要求，峰纯度均能达到0.9990。

2.5 稳定性考察 取“1.3.2”项下配制的对照溶液和供试品溶液，供试品溶液分别放置2、4、6、8小时，测定主成分与杂质的峰面积。主成分的峰面积的变化为0.44%，杂质总量在0.1%以内，没有单个杂质明显增加。说明供试品溶液稳定。

2.6 定量限 将供试品溶液，依次稀释，供试品最终浓度为1.2ηg/ml，进样2μl，信噪比大于3，按主成分计检测限为2.4ng。

2.7 样品测定 照“1.3.2”项下配制供试品溶液，戊四硝酯粉中单个杂质含量为0.10%，杂质总量为0.12%；戊四硝酯片中单个杂质含量为0.03%，杂质总量为0.10%。

3 讨论

3.1 流动相系统 使用常规的色谱柱由于流速过大导致色谱柱柱压过高，本文中方法采用了1.0mlηmin-1流速，同时能将相邻主峰的色谱峰完全分离。

3.2 由于戊四硝酯在碱中易水解，在进行酸碱等破坏时样品极易被降解，随着主峰峰面积的减小，并未发现有更多的杂质色谱峰，很可能有部分杂质是以小分子或无机物存在，在液相色谱系统中无法出峰。因此，应考虑建立一种其他方法检测戊四硝酯的无机杂质，以保证产品的质量。

3.3 文中对本法进行了系统验证，并考察了耐用性，为测定戊四硝酯粉及戊四硝酯片的质量控制提供了保证。