荧光定量PCR法检测儿童肺炎支原体感染及其临床意义

刘玉韶

(广东省中山市博爱医院儿保科,广东中山,528400)

作者采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测本院1 046例疑为呼吸系统MP感染的患儿,探讨FQ-PCR检测MP的临床意义。

1 资料与方法

本院2007年10月～2009年7月期间收治的疑为呼吸系统MP感染的患儿1 046例,年龄出生后4 h～14岁。血液标本102例,痰液358例,咽拭子573例,胸水9例,脑脊液4例。

引 物 序 列 P1:5′GCAAGGGT TCGTTATT TG3′,P2:5′CGCCTGCGCTTGCTTTAC 3′荧 光 探 针 序 列 为:5′AGGTAATGGCTAGAGTTTGACTG 3′(试剂由广州达安基因诊断中心提供)。痰液用高温消毒的吸痰器(下面密封,上端塞橡胶塞,一侧接胃管深入患儿气管取痰,另一侧接硅胶管连接真空泵)抽取受检者痰液1～3 mL置于无菌试管中。4倍体积4%的NaOH室温消化30 min,取1 mL至离心管,15 000 r/min离心5 min,生理盐水洗涤1次,弃上清(血液取淋巴细胞,生理盐水洗涤;咽拭子、脑脊液离心取沉淀),加50 μ L DNA 提取液,混匀,沸水浴10 min,10 000 r/min离心5 min,上清液2 μ L做 PCR反应。

反应管置PE5700自动荧光检测仪。93℃预变性2 min,93℃45 s※55℃120 s,40个循环,荧光激发波长为 487 nm,检测波长为 525 nm,反应结束,由美国 Perkin ELmer公司PE5700自动荧光PCR仪电脑自动分析结果。结果判断:如果Ct值<30,实验结果为阳性,根据MP阳性标准品制作的标准曲线算出DNA含量(基因拷贝数/mL)。Ct值=30,实验结果为阴性。

2 结 果

2.1 MP感染检测结果

1 046例受检患儿中,阳性 432例,阳性率41.30%。其中血液标本102例,阳性25例,阳性率24.51%;痰液 931例,阳性 392例,阳性率42.11%;胸水7例,脑脊液3例,均未检出阳性。受检者中男608例,阳性245例,占 40.30%;女438例,阳性172例,占39.27%,2组比较差异无显著性。432例MP-DNA阳性患儿均有阵发性刺激性咳嗽,大多无痰或少痰;308例伴发热,呈中度热或高热,热型不规则,可持续2周。

2.3 各年龄段PCR检查情况比较

PCR检查结果显示,各年龄段DNA拷贝数无显著性差异,其中学龄前及学龄儿童阳性335例,占77.55%,感染率较高。

2.4 不同种类标本中MP-DNA的比较

102例血标本中MP-DNA的阳性率24.51%,931例咽拭子、痰标本中MP-DNA的阳性率42.11%,2者比较差异有显著性(P<0.05)。

3 讨 论

肺炎支原体感染广泛存在,每3～4年流行1次。平均支原体肺炎占住院肺炎的10%～20%,流行期间可占30%以上。本组血液检出的阳性率和阳性测量值均数与痰、咽拭子标本的PCR检查相比,均有显著性差异,与文献报道一致。若依据血中MP的PCR检查为是否MP感染的依据,有可能造成对MP感染的漏诊,故不宜取血为标本检查来判断是否有MP感染。国外报道从肺炎支原体呼吸道感染的病例血液中直接分离出肺炎支原体,提示肺炎支原体可进入血流,有在呼吸系统以外的部位增殖的可能性。作者从21例血液标本中检测出MP-DNA,与之相符。痰、咽拭子阳性率42.11%,明显高于血标本24.51%,P<0.05,且MP-DNA平均拷贝值亦明显高于血液中,提示仅部分肺炎支原体侵入血液中,引起支原体血症。

聚合酶链反应(PCR)技术用于病原体的检测,其敏感性、稳定性是以往其他检测技术无法比拟的。但存在基因高效扩增造成扩增产物污染而导致假阳性的可能。本实验所用的荧光定量PCR法原理是:把普通基因扩增与分子杂交结合在一起,在常规PCR基础上,设计一条能识别扩增产物的探针,探针采用双荧光标记技术,5′端标记报告基团,3′端标记淬灭基团。当PCR扩增过程中有特异性靶基因时,标记探针与目标靶基因结合,在延伸过程中当引物延伸到探针位置时,Taq酶利用其5′端外切酶活性将探针降解,使报告基团游离,同时恢复了荧光特性,从而产生荧光。荧光强度由计算机自动分析并换算成DNA拷贝数,从而准确定量。整个实验是完全封闭式操作 ,避免了假阳性干扰。该技术从根本上解决了传统PCR产物的污染和不定量的问题,并通过探针杂交进一步提高了特异性,成为替代定性PCR的病原体基因诊断方法。

实验室对MP相关检查常用的方法有:培养法、血清特异性抗体(MP-IgM)检测法、分子生物学方法(如DNA检测法)等。MP分离培养条件要求高,是特异性的诊断方法,但MP生长缓慢,因此临床应用往往受限。MP-IgM检测法具有快速、特异、廉价等优点,已作为我国MP感染诊断的确诊标准之一,但结果往往受抗体出现的时相及患儿年龄、机体免疫系统状况等多方面的影响。国外早已将PCR诊断技术应用于MP的诊断,但由于普通PCR的电泳检测,易引起PCR产物交叉污染,有产生假阳性的可能。一般临床通过血冷凝集试验或血支原体抗体测定来确定MP感染,但两者的高峰出现得较晚,多为2～4周,且受患儿年龄小、免疫力低、病程短及感染轻等方面影响,单凭血清学检测可能漏诊。

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