布鲁氏菌疫苗的研究进展

王羽

(内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特 010018)

布鲁氏菌病的预防主要通过接种疫苗实现。现有的畜用减毒活疫苗有S19、S2、M5和RB51等，死疫苗有牛种布鲁氏菌45/20,羊种布鲁氏菌H38等，人用活疫苗主要有19-B和104M等。现有的疫苗种类有死疫苗、减毒活疫苗等，但是应用效果比较好的还是减毒活疫苗，其它种类的疫苗虽也有人尝试，但效果均不好。我国目前使用比较广泛的减毒活疫苗株有羊种布鲁氏菌减毒疫苗株M5，猪种布鲁氏菌减毒疫苗株S2，以及牛用布鲁氏菌疫苗S19等，其中M5疫苗株是由我国驯化出来的一株弱毒株，在我国的应用广泛，使用效果很好。在这些疫苗株的使用中还发现，它们具有交叉免疫保护效果。现有减毒活疫苗的广泛使用，对于预防布鲁氏菌病的发生、防止疫情进一步蔓延以及疫源地扩大等方面起到了关键性的作用。我国曾一度将布鲁氏菌病控制得很好，就是得益于大范围的使用疫苗预防。随着生物技术的发展，核酸疫苗、蛋白重组疫苗、基因缺失疫苗等基因工程苗成为了科学家们的研究热点。2002年后，伴随布鲁氏菌基因测序的完成，布鲁氏菌疫苗进入了反疫苗学时代。本文就布鲁氏菌的各种疫苗的研究进展作一综述。

一、布鲁氏菌疫苗研究策略的演化

布鲁氏菌病严重影响着畜牧业的发展，研究者对其疫苗的研究已经很多年。其研发策略经历了逐渐改进和完善的过程，根据不同时期研究策略侧重点不同，可以将其大致分为三个阶段。

第一阶段：传统疫苗(活苗，死苗)：在布鲁氏菌防治方面发挥了重要的作用。其中牛用S19，猪用S2，羊用M5，仍然是防治布鲁氏菌病的重要疫苗。在传统疫苗中，活苗的免疫效果虽然很好，但是对接种的动物造成一定的影响，对人也会引起感染，且易发生返祖现象。死苗虽然不会出现上述现象，但其免疫效果不好，用量大，遗传稳定性差。

第二阶段：20世纪70年代以来，迅速发展的重组DNA技术为疫苗的研究提供了新的手段。布鲁氏菌基因工程疫苗也开始发展。核酸疫苗、亚单位疫苗、基因缺失疫苗等成为科学家们的研究热点。基因工程疫苗克服了传统疫苗的易返祖，影响接种动物等不足，且其安全问题比较容易控制和处理，因此，基因工程疫苗将在防治布鲁氏病中做出重大的贡献。

第三阶段：2000年6月26日，人类基因组测序完成标志着人类进入了后基因组时代。疫苗的研究也开始改变过去从表型分析入手的思维方式，而是从全基因水平来筛选具有保护性免疫反应的候选抗原。这种以基因组为基础的疫苗发展策略，称为反疫苗学。2002年以来，羊种、牛种、猪种布鲁氏菌基因组测序相继完成，为反疫苗学研发打下了基础。布鲁氏菌蛋白质组学的研究将成为当今疫苗研究的一个热点。

二、布鲁氏菌疫苗研究现状

(一)布鲁氏菌重组菌疫苗 重组菌疫苗是通过了解布鲁氏菌的基因序列后，灭活其某段基因片段而得到的菌株。目前的研究集中在perosamine合成酶的编码基因的灭活和冷休克蛋白的编码基因灭活后得到的菌株。重组菌得到的疫苗，其毒力比原始疫苗的毒力小，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物，吴清民用羊种布鲁氏菌的重组菌免疫小鼠，得到其免疫保护效力与现有疫苗株相当。通过PCR方法可以鉴定出患病动物体内分离的菌株是疫苗菌株还是野生菌株。但是重组菌疫苗必须有配套的鉴别诊断试剂。该种疫苗还没有进入临床试验阶段，是否有返祖现象还不是很清楚，需要进一步的研究。

(二)布鲁氏菌亚单位疫苗 已知布鲁氏菌基因编码的各种蛋白质产物中Omp,L7/L12等具有抗原性，因而可用基因工程技术，取出布鲁氏菌中编码相应抗原肽段的基因，再将此基因与质粒等载体重组，导入受体菌或细胞，使之在受体菌或细胞内高效表达，产生大量保护性肽段，提取此保护性肽段，加佐剂后即成为基因工程亚单位疫苗。基因工程亚单位疫苗与传统疫苗相比，抗原成分单一，可以用血清学方法有效的鉴别，其抗原为蛋白质，与其他新型疫苗相比不会发生可能出现的基因重组问题，较安全。但是该疫苗为死苗，在体内不能复制，免疫原性不及常规疫苗，而且生产工艺复杂，成本高，故直至目前仍未能普遍推广。

(三)布鲁氏菌基因缺失疫苗 基因缺失疫苗是利用基因工程技术使微生物基因组中控制毒力的基因缺失而制成的疫苗。目前基因缺失疫苗也是布鲁氏菌疫苗的热门研究。据报道，有人用S19作为起始材料，利用基因工程技术去除Bp26和Bmp18得到的弱毒疫苗株△S19-2。该弱毒疫苗接种动物后能与其它菌株感染动物用有效的方法区分开来。并且其毒力明显比S19株弱。也有人去除WboA基因的方法构建基因缺失疫苗。该种疫苗具有良好的安全性和免疫保护性，并且免疫动物后具有不干扰临床诊断的特点。是布鲁氏菌疫苗研究的一个新的热点。

(四)DNA疫苗 由于布鲁氏菌是胞内菌，机体的细胞免疫是控制布鲁氏菌感染的关键，因此作为研究布鲁氏菌DNA疫苗的候选分子主要集中在刺激T细胞引起的细胞免疫的几个分子。目前布鲁氏菌DNA疫苗包括P39，L7/L12，GroEL和Omp31等四种。此外，DNA疫苗具有制备方便，对宿主安全，储藏方便，成本低等特点。目前DNA疫苗研究已经取得了一些有意义的成果，但是至今还没发现一种DNA疫苗可以完全代替灭活苗和减毒苗。

(五)治疗性疫苗 目前，常用的疫苗如S19是通过非肠道途径接种的，可以有效的保护机体避免再次受到布鲁氏流产菌S19的感染。但接种该活菌易产生类似自然感染的症状，诊断困难。并且活菌疫苗有返祖的危险。Pasquali等发现，布鲁氏菌2308的突变株缺乏脂多糖O抗原，但仍然保留毒力，因此通过将该突变株的致病性减弱，构建出RB51疫苗，它在体内不会产生针对脂多糖O抗原的抗体，因此不会给机体造成损害。通过动物实验表明流产布鲁氏菌RB51疫苗经口腔途径免疫后，能够清除体内经不同途径感染的细菌，并产生体液和细胞免疫反应，从而保护机体不被流产氏菌有毒菌株2308再感染。但是不产生抵抗布鲁氏菌的抗体。当前的治疗性疫苗的效果还不十分稳定和理想，因此需要不断进行治疗剂量和免疫次数的优化，改善疫苗组成成分，使治疗性疫苗能推广应用。

(六)联合疫苗 联合疫苗可以减少免疫剂量，简化免疫程序，是目前疫苗研究的一个发展趋势。关于布鲁氏菌的联合疫苗已经进入了实验阶段。研究表明：不同细菌的多种抗原和佐剂制成的多价疫苗，不仅可以一次预防多种疾病，并且免疫后实验动物的免疫原性和免疫保护力都有提高，且各组成成分具有协同作用。在联合疫苗中加入包裹剂和佐剂，增强了抗原递呈细胞对目的抗原的摄取、加工和处理，提高了APC细胞对抗原肽的递呈能力。而且，包裹包还减少了核酸酶降解抗原基因，并通过缓释作用而延长了抗原表达期。

联合疫苗的研究是当前的一个热点，国内外很多研究者都在对此进行研究。如余大海等关于结核杆菌和布鲁氏菌多价DNA疫苗的研究。试验证明：采用治疗型多价DNA疫苗和传统药物相结合治疗，使药物引起的免疫反应，在DNA疫苗的作用下，得到加强并迅速向有利于杀伤感染结核杆菌细胞的TH1型反应进行，治疗时间缩短到原来的一半，减少了抗药性和耐药性的产生，提高了治疗效率。

(七)分子标记疫苗 动物接种疫苗后，由于人工免疫和自然感染动物所表现的临床症状相似，很难鉴别是人工免疫还是自然感染，给动物的检疫、运输、宰杀带来了困难。而分子标记疫苗解决了这样的问题。

目前的分子标记疫苗实验室研究大致有以下方法：(1)改造布鲁氏菌本身的某种蛋白，接种动物后，动物将不能对该蛋白产生免疫反应，进而判定动物是否为自然菌株感染。如布鲁氏菌P39胞质结合蛋白是一种很好的的T细胞抗原，能诱发强烈的迟发性超敏反应，并产生大量的INF-γ，纯化的重组P39对于动物布病的血清学诊断是一个优良的抗原。将P39蛋白改造后的菌株接种动物，该动物将不能对P39产生免疫反应，用它制备抗原避免了混淆人工免疫还是自然感染。(2)带有免疫标记的重组菌疫苗，该疫苗免疫动物后产生了与当前疫苗及自然感染不同的免疫反应状态，通过动物血清的免疫学检测能够将患病动物从免疫动物群体中鉴别出来。(3)在减毒活疫苗株的基础上,对菌株进行改造,敲除布鲁氏菌的重要诊断抗原基因,使疫苗株的毒力进一步降低,然后根据两者序列的差异,建立鉴别PCR的方法,以区分人工免疫和自然感染。

三、展望

布鲁氏菌病属于人畜共患病，近年来又有上升的趋势，严重影响着我国的畜牧业发展。DNA疫苗以其独特的优势成为目前研究的热点。但在临床试验中效果并不如意，所以在未来的研究中应该对DNA疫苗进行改造，包括其载体、接种方式(基因枪技术，电穿孔技术)及佐剂的改造，可以成为布鲁氏菌基因工程苗的下一个研究方向。

布鲁氏菌病在全球再次肆虐，其中的一个原因就是没有有效的人用的布鲁氏菌疫苗来阻断患病动物向人类的传播。伴随布鲁氏菌基因组工作的相继完成，利用功能基因组和功能蛋白组，可以筛选出具有免疫蛋白原性的蛋白质和确定疫苗的候选，使我们有希望达到这个目标，这同样也是布鲁氏菌疫苗研究的一个方向。

另外，结合动物防疫的需要和减少因疫苗注射而引起的应激反应，利用口服植物来表达布鲁氏菌疫苗也是一种较好的选择。

略)