Survivin、Livin、CPP32蛋白与肿瘤相关性的研究进展

刘 伟 王学春

(泰山医学院病理学教研室，山东 泰安 271000)

细胞增殖和凋亡之间的动态平衡决定了多细胞生物体细胞数量，平衡的破坏可导致肿瘤的发生。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)是抑制细胞凋亡的重要成分。Survivin和Livin作为IAP成员，在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。近年来人们对其结构、分布、表达及其与肿瘤的关系做了大量的研究。CPP32(caspase-3)是凋亡执行中的关键效应酶。本文对Survivin、Livin、CPP32蛋白与肿瘤相关性的研究进展综述如下。

1 凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)

凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是高度保守的内源性抗凋亡基因家族的表达产物，肿瘤的发生与其过度表达具有密切的关系。IAP的抗凋亡作用主要通过抑制caspase的活化而达到凋亡抑制作用[1]，目前人类IAP已发现有8个成员，即NAIP，IAP(ILP-1/MIHA)，cIAP-1(HIAP-2/MI-HB)，cIAP-2(HIAP-1/MIHC)，survivin (TIAP)，apollon(Bruce)，ILP-2(Ts-IAP)和Livin(ML-IAP/KIAP)[2]。IAP主要有三个结构域：BIR、RING与CARD结构域[3]。①BIR结构域，即杆状病毒IAP重复序列区(baculovirus IAP repeat， BIR)，位于N端，由含有2个或3个串联的Cys/His的氨基酸残基在内的约70个氨基酸组成，具有高度的保守性[4]。IAP蛋白一般包含1～3个BIR结构域，该结构域是IAP家族抑制细胞凋亡的功能区域。②RING结构域，是一个位于IAP COOH端的锌指样结构单元，它们存在于大多数IAP家族成员之中。③CARDs(Caspase srecruitment domains)结构域,位于IAPs分子的BIR区与锌指结构之间的一系列序列。至今发现人类中仅cIAP1和cIAP2蛋白具有此结构，其功能尚不清楚。所有的IAP家族成员都包含BIR结构，所有的IAP家族成员都包含BIR结构，其余两个结构并非必需[5]。

2 凋亡抑制基因Survivin、Livin

2.1 Survivin、Livin的结构和定位

Survivin是由Ambrosini等[6]于1997年发现，定位于人类染色体17q25,靠近端粒, 全长15 kb,含4个外显子和3个内含子。Survivin的N端只含有一个保守的BIR结构域,无TATA启动子和GC富集区,其COOH端也无IAP家族特有的C端锌指结构,而是有一个独特的α-螺旋结构,富含疏水基团,能与纺锤体微管上的微管蛋白结合,作用于调节细胞周期的功能结构域,抑制细胞凋亡。

Livin是国外学者于2000年在人类基因组cDNA文库中克隆得到，定位于染色体20q13, 全长为4.6kb，包含7个外显子。Livin同样含有IAPs家族成员特有的BIR和RING结构域。Livin BIR功能区是其发挥抗凋亡活性的必需结构，可与caspase结合。RING结构域不参与抑制细胞凋亡的作用，但对Livin在细胞内的合理分布及结构的稳定具有重要的作用。

2.2 Survivin、Livin的分布与表达

Survivin的组织分布特征具有明显的细胞选择性，主要表达于胚胎和发育的胎儿组织,不见终末分化的成人组织(除胸腺和生殖腺外), 而在人类大多数肿瘤组织Survivin的表达特异性增高,且在不同细胞系中其表达量和亚细胞定位不同[7-8]，推测在肿瘤细胞和正常细胞中,Survivin存在的位置不同对细胞的增殖和凋亡作用机制有可能不同。

Livin在正常成人的大多数组织中(除胎盘外)均不表达,表皮、淋巴、脾脏和黑色素细胞表达很低,在胎儿发育过程中高表达,如胎儿的脑、胸腺和肝[9]。Livin在细胞中定位尚无统一结论，有学者[1,9-11]认为Livin主要表达于胞质。但Kasof等[9]认为Livin既在胞质内表达同时也表达于胞核。Vucic等[12]对乳腺癌的研究发现Livin在细胞中主要表达于胞质。

2.3 Survivin、Livin的抗凋亡作用与机制

Survivin是目前已知作用最强的凋亡抑制蛋白，能以特征性的结构直接或间接抑制caspase依赖或caspase不依赖的凋亡途径，有效地对抗细胞的凋亡过程。其机制主要有:①Survivin通过阻断由Caspase-9介导、细胞色素C参与的细胞凋亡信号传导即内源性凋亡途径,间接抑制Caspase-3的活化,抑制细胞的凋亡；②抑制由Fas/Caspase-8诱导的Caspase活化和凋亡,即Survivin可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性,使其不能有效地水解微管结构蛋白,维持了纺锤体的完整性,从而阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程；③Survivin可与辅助性线粒体源性caspase激活因子(second mitochondria-derived activator of caspase,SMAC)结合,进而抑制caspase活性；④Survivin通过非Caspase依赖细胞凋亡的途径,如参与调节p53依赖的凋亡[13],干扰p53的功能进而抑制细胞凋亡；⑤Survivin还可通过对钫锤体微管的作用调节细胞有丝分裂的过程, 通过促进姐妹染色单体精确分离和稳定有丝分裂晚期微管结构而维持了纺锤体的完整性,间接促进了细胞的增殖,抑制细胞的凋亡[14]。

目前对Livin抗细胞凋亡的作用机制了解的并不多，Livin需通过一系列的凋亡刺激物的作用来表现凋亡的抑制，其抑制凋亡的机制主要有:①抗死亡受体介导的细胞凋亡作用，Vucic等[9]研究发现，Livin对Fas，TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1)，DR4(death receptor 4)及DR5(death receptor 5)介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。在Fas/caspase-8诱导的死亡受体途径中，Livin不直接结合caspase-8，而是直接抑制核心蛋白酶caspase-3，从而抑制整条途径发挥抗凋亡途径[15]；②抗线粒体介导的细胞凋亡作用，Livin可与介导细胞凋亡的下游效应caspase,即激活形式的caspase-3,7,9结合，使级联反应中的caspase间的相互作用和核酸的裂解受到抑制，从而导致肿瘤细胞的无限增殖[16]；③抗化疗药物介导的细胞凋亡作用，研究发现，转染Livin基因的MCF7细胞可有效对抗阿霉素、4-TBP(4-tertiary butylphenol)诱导的细胞凋亡[9]。

2.4 Survivin、Livin与肿瘤

2.4.1Survivin、Livin在肿瘤中的表达

凋亡抑制是肿瘤细胞的一个普遍特性，Survivin和Livin作为IAP家族的成员正日益受到人们的关注。肿瘤细胞中凋亡抑制基因的高表达能明显抑制细胞凋亡,逃避机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和清除[17]。大量研究表明，Survivin 和Livin在人类多种类型的肿瘤细胞中高表达。王小娟等[18]采用免疫组化SP检测发现Survivin在胃癌组织中的阳性表达率为80%；秦建伟等[19]采用RT-PCR方法检测发现，乳腺癌组织中Survivin阳性表达率为87.2%，癌旁组织为46.2%；李美玲等[20]采用免疫组化SP检测发现，乳癌组Survivin的阳性表达率为67.9 %；在对MCF-7乳腺癌细胞系的研究中发现，Livin羟基末端的RING结构与细胞内微丝结构结合，从而定位在细胞骨架，使Livin BIR功能区能够有效地抑制Fas、TNFR1、DR4、DR5引起的细胞凋亡，导致乳腺癌的发生[10]；周晟等[21]采用RT-PCR和免疫组化的方法证实，Livin mRNA和蛋白在乳腺癌肿瘤组织中含量显著高于癌旁非肿瘤组织。

2.4.2Survivin、Livin与肿瘤的治疗

目前针对肿瘤的治疗，除了传统的手术治疗、放疗和化疗外，肿瘤的综合治疗特别是基因治疗和免疫治疗为肿瘤的治疗提供了新途径，能够增加对凋亡的抵抗是肿瘤细胞的一个特点。在肿瘤的治疗中如何抑制特殊的抗凋亡因子的作用将会给我们提供一个合理的新的治疗策略。进一步的体外实验证明，在多种肿瘤中IAP的过表达与化疗耐药有关，认为化疗中如果药物能够干预IAP将会起到更好的疗效[22]。

在基因治疗方面，RNA干扰技术和反义核苷酸技术被用来干扰Survivin 和Livin的基因表达，用于增加肿瘤细胞凋亡的易感性。用Survivin反义核苷酸转染的肺癌细胞, Survivin mRNA和蛋白表达量降低，呈剂量依赖性和时间依赖性[23]，细胞生长受限及凋亡指数增加；Crnkovic等[24]使用具有靶向作用的小干涉型RNA(siRNA)干涉肿瘤细胞内生性Livin基因的表达，使Livin基因沉默而不表达蛋白，肿瘤细胞在使用阿霉素、紫外线照射以及TNF-α等凋亡促进剂治疗后，凋亡率大大增加。由此推论，Survivin 和Livin基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点。

在免疫治疗方面，Xiang等[25]构建了Survivin的DNA口服疫苗，用于肺癌小鼠动物模型，发现其可诱导出高度活性树突状细胞(DC),产生有效的特异性CD8+T细胞免疫反应，对抗体内Survivin抗原,抑制新生血管的生成和诱导肿瘤细胞凋亡,消除或抑制小鼠体内肿瘤的转移；Mads等[26]发现在黑色素瘤中，肿瘤细胞表达的Livin作为一种肿瘤抗原物质，在外周血中会产生特异性地识别Livin的抗体，在浸润于肿瘤中针对Livin的反应性T细胞表面包被HLA-A24(human leucocyte antigen-A24)抗原复合体，它对黑色素瘤细胞具有细胞毒作用，因此预示Livin可作为免疫干涉的适当靶点。

3 凋亡调控基因Survivin、Livin与CPP32

3.1 CPP32基因

哺乳动物的细胞凋亡由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族介导[27]。研究[28]表明，多种基因参与细胞凋亡的调控，而caspase蛋白的表达是各种细胞凋亡机制的最后共同通路。CPP32,又称半胱氨酸蛋白酶32(cysteine protease P32，caspase-3)，是caspase家族中与凋亡关系最密切的成员，大多数触发细胞凋亡的因素最终均需通过CPP32介导的信号转导途径导致细胞凋亡。Neill等[29]发现，在良性前列腺增生中CPP32表达明显高于前列腺恶性肿瘤，并且存在着自发凋亡，从而推论CPP32作为凋亡的核心成分之一在肿瘤的自发凋亡中发挥着重要的作用。可见，CPP32在肿瘤中的表达具有重要的意义。

3.2 Survivin、Livin与CPP32的关系

在肿瘤细胞中Survivin和Livin基因均与CPP32基因协同发挥调节细胞凋亡的作用。推测其机制如下：(1)Survivin通过阻断由Caspase-9介导、细胞色素C参与的细胞凋亡信号传导即内源性凋亡途径,间接抑制Caspase-3的活化,抑制细胞的凋亡；(2) Survivin抑制由Fas/Caspase-8诱导的Caspase活化和凋亡,即Survivin可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性,使其不能有效地水解微管结构蛋白,维持了纺锤体的完整性,从而阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程；(3)Livin主要通过抑制凋亡终末效应酶caspase的活性发挥其抑制细胞凋亡的作用[11]。Livin能够直接抑制caspase-3,7,9的水解作用，其BIR结构域能够和caspase结合并抑制caspase的功能。Livin还能够在凋亡起始点直接干扰Procaspase-9或caspase-9的活性，削弱caspase的活化，抑制细胞凋亡发生。

Survivin基因、Livin基因、CPP32基因均为凋亡相关基因，Survivin基因和Livin基因抑制细胞凋亡的发生，而CPP32则可诱导凋亡。这些基因的异常表达或突变影响到凋亡的发生，从而可使恶性变的细胞继续存活，为细胞的DNA进一步损伤或突变提供条件。

4 展 望

肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致，受体内外多重因素调控。目前肿瘤治疗两个最大的问题为放化疗对正常细胞具有毒性作用和肿瘤细胞对药物产生抗性。诱导癌细胞凋亡的肿瘤基因治疗是提高治疗效果的一条重要的途径。Survivin和Livin作为IAP家族成员，其确切的抗细胞凋亡作用已得到证实。因此，研究Survivin和Livin的作用机制可以为掌握肿瘤的发生发展、诊断、治疗及预后提供重要的理论依据，Survivin和Livin有望成为肿瘤的标志物，可能成为肿瘤治疗的新靶点，为肿瘤的诊断治疗开辟一条新途径。但是目前对Survivin和Livin的研究仅仅停留在实验阶段，且大都是体外实验，还有待进一步的临床实验来证实。相信对Survivin和Livin的更深入的研究能够为肿瘤的治疗提供行之有效的新途径。

[1] Kasof GM，Gomes BC．Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member[J].J Biol Chem,2001,276(5):3238-3246.

[2] 孙蕾,谭文华,高展.凋亡抑制蛋白Livin、细胞凋亡与肿瘤治疗[J].中国优生与遗传杂志，2005,13(11):7-11.

[3] 王婷玉,李俊.凋亡抑制蛋白的研究进展[J].安徽医药,2005,9(6):402-405.

[4] Muchmore SW,Chen J,Jakobo,et al.Crystal structure and mutagentic analysis of the inhibitor-apoptosis protein Sruviving[J].J Mol Cell, 2000,6(1):173-182.

[5] Salvesen GS,Duckett CS.IAP proteins:Blocking the road to death’s door[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3(6):401-410.

[6] Ambrosini G, Adida C, Altieri DC, et al. A novel anti-apoptosis gene, Survivin, expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med, 1997,3: 917-921.

[7] Vischioni B, Van der Valk P, Span SW, et a.l Expression and localization of inhibit or of apoptosis proteins in normal human tissues[J].Hum Pathol, 2006, 37:78-86.

[8] Li F,Yang J,RamnathN, et al. Nuclearor cytoplasmic expression of survivin:what is the significance[J].Int J Cancer, 2005, 114: 509-512.

[9] Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro MT,et a1.ML-IAP,a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas[J].Current Biology,2000,10(21):1359-1366.

[10] Ashhab Y,Alian A,PoHiaek A,et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with diferent biological properties and tissue distribution apoptosis pattern[J].FEBS Lett，2001,495(1-2):56-60.

[11] Lin JH,Deng G,Huang Q,et a1．KIAP，a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,279(3);820-831.

[12] Vucic D,Deshayes K,Ackerly H,et a1.SMAC negatively regulates the anti-apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP)[J].J Biol Chem,2002,277(14):12275-12279.

[13] Mitza A, McGuirk M, Hockenberry TN, et al. Human survivin is negatively regulated by wild-type p53 and participates in p53 dependent apoptotic pathway[J].Oncogene, 2002, 21: 2613-2622.

[14] Ansell SM, Arendt BK, Grote DM, et al Inhibition of survivin expression suppresses the growth of aggressive Non-Hodgkin’s lymphoma[J]. Leukemia, 2004, 18: 616-623.

[15] Muzio M,Stockwell BR,et al.An induced proximity mode for caspase-8 acitivation[J].J Biol Chem,1998,273(5):2926-2930.

[16] Nakagawa T, Zhu H，Morishima N,et al. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxity by amyloid-β[J].Nature,2000,403(6765):98-103.

[17] Jaattela M.Multiple cell death pathways as regulators of tumour initiation and progression[J].Oncogene, 2004, 23: 2746-2756.

[18] 王小娟.Bcl-2、Survivin基因在胃癌组织中的表达及意义[J].宁夏医学杂志,2009,31(1):14-16.

[19] 秦建伟.乳腺癌组织中Survivin表达水平的定量检测及其临床价值[J].中国肿瘤临床杂志,2008,35(24):1407-1410.

[20] 李美玲,高美华.Survivin和Caspase23在乳癌组织的表达及相关性[J].齐鲁医学杂志,2009,24(5):377-382.

[21] 周晟,万婕.凋亡抑制基因Livin与Survivin在人乳腺癌中的表达差异[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2006,15(5):554-558.

[22] 李中福,王子卫.新的凋亡抑制蛋白Livin的研究及临床意义[J].重庆医学,2005,12(34):1892-1895.

[23] 陈余清,李伟,周继红,等.Survivin抗肺癌细胞凋亡的分子机制[J].中华肿瘤杂志,2006,28:413-417.

[24] Crnkovic-Mertens, Felix Hoppe-Seyler, Karin Butz. Induction of' apoptosis in tumor cells by siRNA-mediated silencing of the livin/ M L-IA P/ KIA P.gene[J].Oncogene,2003, 22(51):8330-8336.

[25] XiangR,MizutaniN,LuoY, et al. ADNA vaccine targeting survivin combines apoptosiswith suppression of angiogenesis in lung tumor eradication[J].Cancer Res, 2005, 65: 553-561.

[26] Mads HA,Sine Reker, Jurnen CB, et al. The melanoma inhibitor of apoptosis protein: a target for spontaneous cytoxic T cell responses[J].J Invest Dermatol,2004,122(2):392-399.

[27] Robertson GS,Crocker SJ,Vicholson DW,et al.Neuroprotection by the inhibition of apoptosis[J].Brain Pathol, 2000,10(2): 283-292.

[28] 张伟,周韧,陈培辉.人类Caspase家族蛋白酶与凋亡[J].国外医学:遗传学分册,1999,22 (6):290-293.

[29] O'Neill AJ, Boron SA, O'Keane C,et al. Caspase-3 expression in benign prostatic hyperplasia and prostate carcinoma[J].Prostate,2001,7(3):183-188.