SSR标记及其在园艺植物育种中的应用

苗明军，李成琼，司军

（西南大学园艺园林学院，重庆北碚，400715）

真核基因组中广泛存在着由1～6个碱基对组成的简单重复序列 （Simple Sequence Repeats,SSR），又称为微卫星DNA[1]。SSR广泛分布于真核生物基因组中，少数原核生物基因组中也有[2]，而且分布比较均匀，每隔10～50 kb就存在1个微卫星[1]，其主要以两个核苷酸为重复单位，也有一些微卫星重复单位为3个核苷酸，少数为 4 个核苷酸或者更多，如（CA）n、（GA） n、（GAA）n、（GATA）n 等。人和动物中的微卫星重复单位主要为（TG），植物基因组中（AT）重复较（AC）重复更为普通[3]。SSR标记因为具有共显性、高度重复性、高度丰富的多态性等优点，成为构建遗传连锁图谱、基因定位、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测、分子标记辅助育种、目标性状分子标记筛选的理想工具。目前，在植物基因组中SSR标记研究非常活跃，已在拟南芥、花生、葡萄、苹果、番茄、辣椒、甜菜等多种园艺植物上得到广泛的应用。本文主要综述SSR标记的原理、特点及其在园艺植物育种方面的应用。

1 SSR标记技术原理及特点

1.1 SSR标记技术的特点

SSR应用广泛是因其具有以下特点：①SSR标记数量丰富，标记覆盖整个基因组，而且分布均匀；②SSR标记为显性标记，呈孟德尔式遗传，具有很好的稳定性和多态性，因而能够鉴定纯合体和杂合体；③DNA用量少，仅需微量组织，且DNA有点降解也能进行分析鉴定；④具有多等位基因的特性，提供的信息量大；⑤技术要求低，易于实现自动化；⑥引物序列公开发表，易在各实验中广为传播使用。与其他分子标记（AFLP、RAPD、RFLP等）相比，所测的位点多态性明显高于RFLP标记，而且重复性优于RAPD，与AFLP相比，不同的材料结果略有不同。所以SSR兼有RFLP和RAPD的优点，克服了它们的不足。SSR标记能够在短时间内对大量样品进行分析，具有更强的实用性和更大的应用前景，成为目前分子标记技术的热点。

1.2 SSR标记技术的原理

SSR标记是指由1～6个碱基组成的基本序列串联重复组成的短片段，是建立在PCR反应基础上的共显性标记。SSR的产生是在DNA复制或修复过程中DNA滑动和错配或者有丝分裂、减数分裂时姊妹染色单体分配不均等交换的结果[4]。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。微卫星的突变率很高，从而产生了很多的等位基因，导致了微卫星的高度多态性。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列是保守的单拷贝序列，据此可以设计一对特异引物，对基因DNA进行PCR扩增，将扩增产物在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶上进行电泳分离，从而检测出DNA的多态性，即检测出不同个体在每个微卫星座位上遗传结构的差别[5]。

2 SSR标记在园艺植物育种研究中的应用

2.1 亲缘关系和遗传多样性的研究

SSR标记具有高度多态性且信息丰富，能够准确区分大量的等位基因，因而可以区分同一物种不同基因型，甚至是亲缘关系特别近的材料，也是遗传差异研究的主要工具。Scott等[6]根据从5 000个葡萄表达序列标签（ESTS）中分离的124个微卫星而设计的16对SSR引物，对7个葡萄资源进行分析。结果表明，在3'非翻译区（3'UTR）分离的微卫星在品种间具有较高的多态性；在5'非翻译区（5'UTR）分离的微卫星在种和品种间具有较高的多态性；而在编码区分离的微卫星在种和属间具有较高的多态性。宋建等[7]从400对SSR引物中筛选出24对多态性高、扩增稳定、重复性好的引物，对来自国内外的36份番茄材料进行SSR标记，之后利用NTSYS软件对所得结果进行聚类分析，36份材料被聚成7大类，说明番茄材料之间存在一定程度的遗传分化，野生种的亲缘关系较远；而栽培番茄的亲缘关系较近，遗传背景狭窄；野生种与栽培品种之间的亲缘关系也较远。

遗传多样性是指种内不同种群之间或一个种群内不同个体间的遗传变异。它是园艺植物种质资源利用和保护的基础。SSR标记揭示的多态性水平高，非常适用于遗传分析和系统进化研究。Smulders等[8]对番茄栽培和其他的番茄种中用44个微卫星引物研究后发现，其中的36对引物能扩增出片段，29对（86%）微卫星标记在其他的番茄种中表现出DNA多态性，10对（28%）引物在7个栽培种中表现出多态性，平均每个位点检测到等位基因2～4个，有的位点最多可检测到的等位基因数为8个，结果表明这些SSR标记可用于亲缘关系较近的番茄品种间的鉴定。Kwon等[9]用316对SSR引物对在形态特性上有差异的6个辣椒品种进行引物筛选，其27对（8.5%）表现出多态性。用这27对引物对66个辣椒品种进行检测，平均每个位点检测到3.29个等位基因。Desplanque等[10]1999年用SSR试验了法国各地54个种群300个甜菜品种的遗传多态性，发现野生甜菜比栽培甜菜表现明显的遗传多态性。唐开学等[11]利用18对SSR引物对42份材料DNA进行PCR扩增，在18个位点共检测到148个等位基因，每1位点的等位基因变幅为6～14个，平均8.2个。材料间遗传相似系数为0.282～0.892，表明在分子水平上具有丰富的遗传多样性。在相似系数为0.456时，基于SSR标记的聚类分析将13个蔷薇野生种分为5个组，这与植物形态学分类结果大体一致。在遗传相似系数为0.143时，聚类分析将42份供试材料分为5大组群。初步探讨了野生种之间以及野生种与栽培品种之间的亲缘关系。

穆生奇等[12]利用62对多态性SSR引物对59份黄瓜材料进行了遗传多样性分析。聚类分析结果将供试材料分为7大类群，第1类包含6个欧洲温室型材料，全为无刺瘤类型；第2类是4个美国类型种质，属于小果型材料；西双版纳黄瓜D59单独聚为第3类，且与其他材料的遗传距离均大于0.33；疑为华南型种质的D38，单独聚为第4类，其果实为乳白色；第5类包括D13及其父本D39，两者含有欧洲和华北血缘；第6类为叶色突变材料D28，是欧洲型和华北型黄瓜的后代；第7类包括33个华北型材料、7个华南型材料和4个日本型材料。主成分分析与系统聚类分析结果基本一致。两种分析方法的分类结果与形态学分类相吻合。

2.2 品种鉴定

SSR标记对品种的鉴定实质上是对基因型的鉴定，使品种鉴定和分类直接从DNA分子水平上进行，准确度高，效率高，容易鉴别出同一物种的不同基因型，已成为一种有效的品种鉴定方法。SSR指纹图谱将为品种提供独特的鉴定特征。结合SSR多态性及其精确的片段大小，便可建立每一品种的标准图谱，以鉴别品种。Bowers等[13]应用SSR技术成功地鉴定了酿酒葡萄品种Cabernet-Sauvignon的亲本。Garlos等[14]利用3个微卫星标记就能区分21个苹果品种。韩宏伟等[15]根据目前基因库中梨的DNA收录序列设计开发SSR引物，用筛选出的6对图谱清晰SSR引物可以将供试的19个主要梨栽培品种鉴别分开。Provan等[16]用SSR标记鉴定马铃薯种内体细胞杂种，这种方法可用愈伤组织检测并且可以自动化操作，从而大大节省常规检测方法所需的时间和费用。王爱德等[17]利用SSR方法对25个苹果品种进行了基因组多态性分析，用2对引物（GD142和02b1），即可区分全部供试品种。郑轶琦等[18]通过对16对高多态性的猕猴桃SSR引物筛选，选用9对稳定、适用性好的引物对我国栽培的48个猕猴桃品种（品系）进行了初步研究，在9个多态性位点上共获得213个等位基因片段，其SSR指纹图谱可将供试品种完全区分开。Coart等[19]采用SSR和AFLP标记，将欧洲野生森林苹果与栽培苹果品种基本区分开来，并发现野生种在植物学性状上与现代栽培品种有明显差别。艾呈祥等[20]以两个甜瓜杂交品种（系）“东方蜜1号”和“01-31”及其亲本为材料，用SSR引物M6对“东方蜜1号”和引物M17对“01-31”各100粒单种子进行SSR鉴定，所测纯度分别为100%和96%，与田间纯度99.6%和96.2%非常接近，显示出SSR标记技术在甜瓜杂交种子纯度的室内快速检测中有广泛应用前景。王全等[21]在黄瓜上研究表明，利用60多对SSR引物对津优1号及其亲本进行PCR扩增，其中有1对SSR引物在双亲及杂种后代中表现共显性分离，进行杂种种子的纯度鉴定，结果显示，SSR标记方法与田间鉴定方法可靠性都在96%以上。

2.3 构建遗传连锁图谱

遗传图谱是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图，是植物遗传育种及分子克隆等应用研究的理论依据和基础[22]。SSR标记的单个位点具有多个等位基因，而且每一遗传型仅有一个等位基因，多态性丰富等优点，是构建高密度分子遗传图谱的有效工具。Liebhard 等[23]用 475 个 AFLP、235 个 RAPD、129个SSR和1个SCAR共840个标记构建了较为饱和的苹果遗传图谱，覆盖了遗传图谱中1 450 cM，129个SSR标记，分布在17条连锁群上，这为不同构图群体或品种间标记转换、基因定位和克隆奠定了坚实的基础，该图是目前关于苹果基因组的最致密的一张分子连锁图。Han等[24]构建了赤豆[Vigna angularis(Willdenow)Ohwi et Ohashi]的遗传连锁图谱,其中包括205个SSR标记、187个AFLP标记和94个RFLP标记,它们分布于赤豆单倍体的11个连锁组群上，总长度为832.1 cM，标记间的平均间距1.85 cM。Joobeur等[25]用RAPD和SSR标记共同构建了扁桃的第二代遗传图谱，验证了应用SSR标记补充已构建的连锁图或新建果树遗传图谱的可行性。Yamamoto等[26]利用巴梨×丰水的F1代群体，构建了巴梨和丰水的遗传连锁图谱。巴梨的遗传连锁图谱由226个位点组成，其中有175个AFLP标记、49个SSR位点；丰水的遗传连锁图谱由154个位点组成，其中有106个AFLP标记、42个SSR位点。2个图谱之间可通过20个共显性位点（19个SSR位点和1个自交不亲和的S位点）部分连接，进而找出二者之间的关系。Liebhard等[27]利用129个SSR标记和其他的标记构建了目前饱和度最大的苹果遗传图谱。

2.4 种质资源保存和利用

SSR技术在园艺植物种质资源上的研究比较广泛，用以鉴定品种的真实性，防止混杂、外来花粉授粉及遗传漂变。俞明亮等[28]对桃种间亲缘关系进行了SSR的鉴定，发现桃亚属间普通桃与新疆桃的亲缘关系最近，陕甘山桃与甘肃桃间也有较近的亲缘关系。Carlos等[29]建立了优化的SSR技术体系用于鉴定柑橘珠心苗。聚类分析的结果与已知地理起源和谱系完全吻合，并且鉴别出两个定错了名的种质。这将对种质资源的收集保存和利用发挥重要作用。

2.5 基因定位及分子标记辅助育种

基因标记是筛选与目的基因紧密连锁的遗传标记，它是基因图位克隆和分子辅助选择育种的前提。Cevik 等[30]利用“Prima x Fiesta”产生的群体借助AFLP和SSR分离检测到了3个新的抗蚜虫的基因位点，AFLP所得到的标记与SSR标记SdSSRa和2B12a仅相差1.3 cM，而且还表明Sd-1与Sd-2紧密连锁，可能是等位基因。Patocchi等[31]通过SSR标记（CH02C02a）发现了一个新的抗黑星病基因Vr2。Terakami等[32]定位了日本梨品种Kinchaku疮痂病抗性基因Vnk，研究中，利用从梨和苹果中获得的SSR引物确定了疮痂病抗性基因Vnk的图谱位置，几种DNA标记技术（AFLP，RAPD）都能显示所获得的基因，测定了梨和苹果疮痂病抗性基因Vnk之间的关系。安静等[33]应用AFLP、RAPD和SSR标记构建了辣椒的分子遗传连锁图谱，并进行了辣椒抗疫病基因的QTL定位。他们构建了辣椒分子遗传连锁图谱，并进行了辣椒抗疫病基因的QTL定位。辣椒分子遗传连锁图谱包括12个连锁群，70个标记位点，其中AFLP标记54个，RAPD标记15个，SSR标记1个，覆盖长度为429.02 cM，平均图距为6.13 cM，连锁群长度为4.30～85.85 cM。在第4连锁群上检测到抗疫病基因的两个QTL位点：一个QTL位点的LOD值为2.89，在连锁群上的支持区域是0～7.2 cM，距离最近的标记E 41M 53-7仅0.4 cM；另一个QTL位点的LOD值为 4.18，在连锁群上的支持区域是13.6～35.6 cM，距离最近的标记E 41M 52-6为7.0 cM，两个QTL可解释表型变异的贡献率分别为9.5%和16.4%。王坤等[34]用分离群体分组分析法（BSA）和微卫星多态性分析（SSR）技术对红花芸豆中的抗炭疽病基因进行分子标记鉴定，用Mapmaker3.0计算标记与目的基因间的遗传距离，发现B6连锁群上的4个SSR标记BM170、Clon1429、BMD37、Clon410 与 抗炭疽病基 因 Co-F2533连锁，遗传距离分别为6.6、18.4、20.9和30.9 cM，这些SSR标记与Co-F2533基因在B6连锁群上的排列顺序为Clon1429-Co-F2533-BM17-BMD37-Clon410。根据基因所在连锁群的位置、抗病基因的基因库来源可知，Co-F2533是一个新的来源于安第斯基因库的抗炭疽病基因。

分子标记用于辅助选择育种可提高选择的准确性和效率，缩短育种年限。分子标记辅助选择是现代分子生物学与传统育种学的结合，借助与目的基因紧密连锁的分子标记，对育种材料从DNA水平上进行选择，从而避免了依赖于表现性状的表现间接推断其基因型。Yan等[35]利用含有365个AFLP和SSR标记的二倍体月季连锁图谱进行了数量性状定位，确定了3个与叶面积、2个与叶绿素含量相关的QTL位点，这将有助于月季生长活力的分子辅助选择。张桂粉等[36]采用SSR标记和BSA法相结合的技术，找到了一个与桃熟性性状基因紧密连锁的分子标记 P21 （5′→3′ATTCGGGTCGAACTCCCT，5′→3′ACGAGCACTAGAGTAACCCTCTC）。 Dalbo 等[37]曾对分子标记在葡萄抗白粉病辅助选择中进行白粉病抗性选择，可将感病个体范围由原来的24%～52%降低为2%～18%，显示了分子标记辅助育种的优越性。

3 展望

SSR标记技术发展至今，已成为理想的分子标记，SSR标记在辣椒、番茄、甜菜、葡萄、苹果等许多园艺植物亲缘关系、遗传多样性、品种鉴定、遗传图谱构建、种植资源的保护和利用、基因定位及分子标记辅助育种等方面得到了极好的应用。SSR标记还在QTL分析、物种起源和进化、品种改良及杂种优势预测中表现出巨大的应用价值和优势，提高了育种效率。SSR获得微卫星DNA标记一般需要建立、筛选基因组文库，克隆测序，引物设计等一系列试验，人力、物力消耗巨大，开发有一定的困难，费用也较高；而且SSR标记中所使用的引物不同，试验结果差异也大；PCR引物在不同物种间保守性较差，对于不同物种要进行特异性引物设计，这就不利SSR标记的发展。但微卫星DNA仍然是研究当前种内遗传变异中分辨率最高、揭示力最强的核DNA标记。且SSR标记引物一经开发出来，将一直受益，因此，需要加大SSR标记引物的开发。我国拥有丰富的园艺植物种质资源，随着SSR标记技术不断发展和完善，相信它将会推动我国园艺植物遗传育种研究进入一个新的阶段。

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