胶体金免疫层析技术在动物疫病诊断上的应用*

祖立闯,王金良,李 娇,沈志强,*

(1.山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600;2.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州 256600)

胶体金免疫层析技术在动物疫病诊断上的应用*

祖立闯1,王金良2,李 娇1,沈志强1,2*

(1.山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600;2.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州 256600)

胶体金免疫层析技术是在胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术基础上发展起来的一种新型免疫学诊断技术。因其具有简便、快速、无污染、不需特殊仪器、特异性强、敏感性高、结果判断直观等优点,成为当前广泛采用的动物疫病免疫学诊断技术。胶体金免疫层析技术在动物病毒病、细菌病、寄生虫病及水产动物疫病诊断方面都有非常广泛的应用,在未来的动物疫病诊断中将发挥越来越重要的作用。论文就胶体金免疫层析技术在动物疫病诊断上的应用进行综述。

胶体金免疫层析;动物疫病;诊断

自1971年Faulk WP和Taylor G M用兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合,制备成金标抗体检测细菌表面抗原的分布[1],将胶体金首次引入免疫化学后,胶体金免疫标记技术(immunogold labelling techique)成为继荧光素标记、放射性同位素标记和酶标记之后发展起来的一种新型的固相免疫标记技术[2]。30多年来,胶体金免疫标记技术得到不断的发展和成熟,在医学、农牧业、环保及食品安全领域得到了广泛的应用。该技术在动物疫病诊断方面的应用虽然起步较晚,但发展迅速。其中,胶体金免疫层析技术(gold immunochromatography assay,GICA)由于具有简便、快速、特异、灵敏等优点,已成为当前动物疫病检测中最简单、快速、敏感的免疫学检测技术之一,特别适合于广大基层兽医人员以及大批量检测和大面积普查等,有巨大的发展潜力和广阔的应用前景[3]。本文就胶体金免疫层析技术(GICA)在动物疫病快速检测上的应用现状及发展前景做一简要综述。

1 胶体金免疫层析技术的原理

胶体金免疫标记技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。它主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中[4]。免疫层析(immunochromatography,IC)技术是出现于20世纪80年代初期的一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的基础上建立的一种简单、快速的免疫学检测技术[5]。胶体金免疫层析技术(GICA)是一种将胶体金标记技术、免疫层析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术[3]。它的原理是以条状纤维层析材料为固相,通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动,并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(抗原或抗体)发生高特异性、高亲和性的免疫反应,层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带),运用可目测的标记物(胶体金)而得到直观的实验现象(显色),而游离标记物则越过检测带,与结合标记物自动分离。胶体金免疫层析技术(GICA)就是利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术而达到检测的目的,层析时使用胶体金这种标记物,标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色,以纤维膜上显色带的有无进行快速检测[6]。

2 胶体金免疫层析技术的特点

胶体金免疫层析技术(GICA)在诊断技术中的迅速崛起主要是因为与其他检测方法相比较,存在着多方面的临床检测优点。

2.1 检测面广

胶体金免疫层析技术(GICA)既可用于检测抗原,也可用于检测抗体。广泛应用于动物疫病快速诊断和兽药残留快速检测等领域。

2.2 操作方便

具有操作步骤简单、无需特殊仪器、样本无需特殊处理、检测结果可直接用肉眼判读等特点,对操作人员无特殊技能要求。

2.3 快速

一般只要5 min～10 min就会出检测结果,相比其他方法,如ELISA 需1 h～2 h,PCR需3 h～4 h,大大的缩短了检测时间,这是目前其他快速检测方法所无法达到的。

2.4 灵敏

采用高质量的单克隆抗体,快速诊断分析检测下限可以达到10 pg。利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理,采用银显影剂增强金颗粒的可见性,大大提高了测定的灵敏度,可以超过ELISA的灵敏度水平。

2.5 特异

胶体金大多用于单克隆抗体标记,对组织细胞的非特异性吸附作用小,故具有较高的特异性。

2.6 方便

由于胶体金标记蛋白质是一物理结合过程,结合牢固,很少引起蛋白质活性改变,所以试剂非常稳定,不受温度等外界因素影响,可随身携带,随时检测,检测结果也可长期保存。

2.7 经济实用

因为具有“免疫浓缩”效应,检测所需试剂和样本量很少,样本量可低至100 μ L,再加上无需任何仪器和设备,并且可单份标本检测,使检测成本大幅下降。

2.8 安全环保

因为没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与,所以既不会损害操作者健康,也不会污染环境,具有放射性同位索或酶标等检测方法所无法比拟的安全性。

3 胶体金免疫层析技术在动物病毒病检测中的应用

Oh J S等[7]建立了检测犬瘟热病毒抗体的胶体金免疫层析方法,通过检测临床的386份样品,得出GICA相对于血凝抑制试验(HI)的敏感性为97.1%,特异性为76.6%。Joon Tam Y等[8]研制了检测伪狂犬病病毒抗原的胶体金试纸条,该试纸条检测时只需25 μ L样品,5 min即可出检测结果,与常见猪病不发生交叉反应。Peng D等[9]在家禽禽流感病毒检测中,对胶体金免疫层析试纸条、血凝抑制试验、琼脂凝胶免疫扩散试验进行了比较,得出胶体金免疫层析试纸条具有敏感性高、特异性强、简便、快速、价格低等优点,是家禽流感病毒快速检测的最有效技术。Kameyama K等[10]建立了快速检测BVDV抗原的胶体金免疫层析试纸条,该方法与病毒分离鉴定的敏感性和特异性分别为100%和97.2%,为BVDV的快速诊断提供了一种有效的检测方法。Cui S J等[11]建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体胶体金试纸条,将该试纸条与HI相比较,敏感性和特异性分别为88.8%和97.6%,并且认为该方法简便快速、不需仪器设备,必将在现地H5N1亚型禽流感病毒抗体的检测中得到广泛的应用。徐一鸣等[12]用亲和层析法纯化的禽流感病毒(AIV)H3和H7亚型单克隆抗体包被胶体金,依次将纯化的马抗H3和H7亚型AIV多克隆抗体和山羊抗鼠二抗分别包被于硝酸纤维素(NC)膜上作为检测线和质控线,建立了鉴别检测H3和H7亚型禽流感病毒胶体金免疫层析试纸条,用该试纸条对H3和H7亚型AIV标准抗原、毕赤酵母真核表达蛋白和已知样品进行检测,结果与 HA、AC-ElISA和RT-PCR方法相符。彭伏虎等[13-14]在建立H9亚型禽流感病毒胶体金免疫层析检测方法的基础上组装成了试剂盒,试剂盒由试纸条、稀释液、样品管、塑料吸管、一次性手套及说明书组成,对试剂盒的特异性、敏感性、保存期和重复性等进行的测定表明,试剂盒在室温可以保存6个月,4℃可以保存12个月,与HA试验相比特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简单、方便、快捷,能在10 min内准确检测出样品中是否含有H9亚型禽流感病毒,用该试剂盒对武汉市及周边地区的鸡场共抽检498份样品,经病毒分离鉴定准确率达到100%。徐葛林等[15]用胶体金标记抗狂犬病病毒单抗建立的检测狂犬病毒的胶体金免疫层析法,只与狂犬病毒抗原有特异性反应,与乙型脑炎病毒、正常小鼠脑组织等无交叉反应,检测48份可疑狂犬病犬唾液样品,同酶联免疫试验(EIA)的符合率为88.2%,该诊断试纸条非常适用于野外对动物脑或唾液中的狂犬病病毒抗原的检测。李希友等[16]用胶体金标记新城疫病毒(NDV)抗原,兔抗NDV抗体和NDV抗原分别包被到NC膜的检测线和质控线上,研制出了半定量快速测定新城疫抗体的胶体金免疫层析试纸条。郑鸣等[17]用胶体金分别标记猪瘟强、弱毒抗原,应用双抗原夹心法于国内首先建立了区分猪瘟强、弱毒抗体的胶体金免疫层析试纸条,该方法操作简单、灵敏度高、特异性好、能区分强弱毒感染,适合猪瘟的临床诊断。蒋韬等[18]以纯化的豚鼠抗O型FMDV多克隆抗体制备为金标探针,兔抗O型FMDV多克隆抗体和羊抗豚鼠IgG分别标记于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带,研制了O型口蹄疫病毒免疫层析试纸条,灵敏度与特异性试验结果显示:试纸条最高可检测到1∶256倍稀释的O型标准鼠抗原,灵敏度略高于反向间接血凝试验。王中力等[19]标记纯化的犬细小病毒单克隆抗体建立了检测犬细小病毒的胶体金免疫层析法,检测收集到120份犬粪便样品,其结果与HA结果相对比,HA效价在1∶40以上时试纸条均能检测到阳性结果,与犬瘟热病毒及犬传染性肝炎病毒无交叉反应。王慧杰等[20]引用胶体金标记PCV-2重组Cap蛋白制备了检测猪圆环病毒2型Cap抗体的胶体金快速诊断试纸条,试验结果表明该试纸条特异性高,能够区分PCV-2的标准阴、阳性血清,用该试纸在检测来自不同猪场的165份送检血清,与间接免疫荧光符合率在 85%以上。国内,检测猪蓝耳病病毒抗体、牛白血病病毒抗体、动物狂犬病毒抗体、新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原的免疫胶体金试纸条均已研制成功并申请了专利。

4 胶体金免疫层析技术在动物细菌病检测中的应用

Suzuki T等[21]通过对试纸条和PCR的比较,得出胶体金免疫层析方法简便、快速、准确、安全且同样具有良好的特异性和敏感性。Soo P C等[22]建立了检测结核分支杆菌的胶体金层析试纸条,临床评价试验证实,建立的胶体金免疫层析方法简便、快速、具有良好的特异性和敏感性、该诊断试纸条非常适用于野外及基层兽医实验室使用。檀华等[23]将胶体金标记葡萄球菌蛋白A,用类鼻疽多糖抗原包被NC膜,组装成免疫层析试纸条检测类鼻疽假单胞杆菌,用该试纸条和间接血凝试验检测了3份兔血清、16份猪血清和26份人血清标本,试验表明,试纸条与间接血凝试验的结果一致,具有较好的特异性和敏感性。张书环等[24]建立的牛分支杆菌抗体胶体金快速检测技术,交叉试验证明该种试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性,进行临床样品检测时,与牛分支杆菌分离培养的符合率为85.00%,与结核菌素皮内变态反应的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%。朱明东等[25]所建立的诊断布鲁菌病的胶体金免疫层析法采用不同血清的用量确定敏感性及特异性,得出GICA的敏感性和特异性分别达到91.3%和97.3%,认为应用GICA快速诊断牛布鲁菌病具有敏感、特异、血清用量少、操作简便等特点,更适合于布鲁菌病的诊断、流行病学调查及现场应用。高成秀等[26]建立了大肠埃希菌O 157和Stx2毒素的双抗体夹心免疫胶体金层析法,可以同时检测大肠埃希菌O 157抗原和Stx2毒素,可在较短时间内检测大肠埃希菌O 157并鉴定产Stx2的高致病性大肠埃希菌O 157,具有较高的特异性,在临床中有较高的应用价值。孙洋等[27]以肠出血性大肠埃希菌O 157单克隆抗体为标记探针,以兔抗O 157多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,利用双抗夹心法,制成O 157胶体金免疫层析检测试纸条,该试纸条仅与O 157反应,与其他受试菌株均不反应,该试纸条敏感性高、特异性强、检测速度快、操作简便、可用于现场大量样品的检测。目前,国内已经有检测动物布鲁菌病抗体、动物布鲁菌病抗原及猪链球菌2型抗原的免疫胶体金试纸条研制成功并申请了相关专利。

5 胶体金免疫层析技术在动物寄生虫病检测中的应用

何伟等[28]建立了简便、快速的胶体金试纸条检测家畜血清中的抗血吸虫抗体,检测了33份阳性牛血清和50份阳性猪血清,阳性检出率均为100%,检测23份阴性牛血清和50份阴性猪血清,结果分别出现1份和3份阳性反应,阴性符合率分别为95.7%和94.0%,检测感染肝片形吸虫的牛和羊血清共计16份,有3份阳性,交叉反应率为18.8%,表明该方法敏感性高,特异性较强。王艳华等[29]用建立的检测弓形虫抗体的免疫胶体金快速试纸条对动物弓形虫病血清抗体进行检测,并用弓形虫IHA诊断方法进行对照试验,结果表明,金标试纸的敏感度高于IHA,与弓形虫IHA检测结果的符合率为82.5%,且较弓形虫IHA诊断试剂提前2 d检测到抗体。张守发等[30]应用胶体金免疫层析法与ELISA法检测了现地的147份血清样本,得出GICA相对于ELISA的阳性符合率为100%,阴性符合率为88.4%,总符合率为87.8%,认为GICA与ELISA法相比,具有敏感性高、特异性强、快速、准确、可单份操作、也可大批量检测、结果易懂、无需仪器设备、操作人员无需进行技术培训等优点,胶体金免疫层析法作为牛新孢子虫病的一种血清学检测方法有着良好的实用价值,适宜于基层兽医单位的应用。

6 胶体金免疫层析技术在水产动物疫病检测中的应用

随着我国畜牧业的健康发展和对动物疫病检侧要求的提高,胶体金免疫层析技术(GICA)作为一种可靠的免疫学检测技术,特异性强、灵敏度高、简便快速、无需特殊仪器设备,在动物病毒病、细菌病、寄生虫病的检疫工作中广泛用于病原微生物的抗原、抗体检测,大大提高了动物疫病的检测效率。但GICA在水产动物疫病检测中的应用才刚刚起步。2006年,Wang X J等[31]建立了检测虾白斑综合征病毒抗原的胶体金免疫层析试纸条,该方法的敏感性高于斑点免疫印迹测定试验(dot-blot nitrocellulose enzyme immunoassay,DB-NC-EIA),因不需要仪器设备,必将成为虾白斑综合征病毒的快速检测技术。国内,武汉大学的孟小林等发明了一种检测对虾白斑综合征病毒的试纸条制备方法,并申请了专利[32]。

7 胶体金免疫层析技术的发展趋势

胶体金免疫层析技术自诞生以来便以其简便、快速、特异、敏感等优点被广泛应用于快速检测和现场诊断上,显示出了巨大的发展潜力和广阔的应用前景。随着胶体金标记对传统三大标记物的替代,胶体金免疫层析技术(GICA)也有逐渐取代ELISA等检测方法的趋势。随着该技术的临床应用,进一步提高胶体金免疫层析试验的敏感性、特异性、实现多元检测、实现定量或半定量检测是未来胶体金免疫层析技术发展的方向。

7.1 进一步提高检测灵敏度

灵敏度的提高无疑会拓宽胶体金免疫检测技术的检测范围,以下二种方法将成为以后的研究方向:①提高胶体金质量。进一步完善免疫胶体金的制备工艺,使之标准化、程序化,以利于提高检测准确性和可重复性,从而减少假阴性(假阳性)结果的产生。②采用生物素-亲和素系统以及免疫金银染色法(IGSS)放大特异抗原抗体的反应信号,增强金标记物的显色效果,提高检测灵敏度,无需特殊仪器设备的支持,将有效地拓宽胶体金免疫结合试验的检测范围。

7.2 实现半定量或定量检测

目前,免疫胶体金技术定量检测有3种类型:第1种是通过试纸条的颜色深浅的视觉比较将结果分为阴性、弱阳性、中阳性和强阳性;第2种是将检测线的反应剂设计成只能结合已知一定量的分析物,任何过量的分析物将会和下一条检测线结合,产生一个温度计式的条带梯度;第3种是应用反射的光密度计测量显色带或斑点的颜色强度,将颜色强度转化为数字指标。前两种检测方法虽简便迅速,但只能提供半定量结果;第3种检测方法虽能实现定量检测,但需特殊的仪器,操作不便。新的、简便实用的定量检测技术的实现将使免疫胶体金技术在兽医快速检测上得到更为广泛的应用。

7.3 实现多元检测

在同一膜上固定多种反应物,即可作多种项目的测定,一次测定可以同时得到多组的测定结果,实现对多个指标的联检。可进一步减少待检时间,降低检测成本,并集中得出数据。

7.4 通用试剂的应用

研发多个检测指标的通用试剂,如在间接法检测中用胶体金标记葡萄球菌蛋白A代替标记抗动物IgG,用于各种抗体的检测,有利于减少非特异性反应,稳定检测试剂的质量。

8 结语

目前,兽医临床上许多病的诊断方法仍较多地局限于传统的血清学诊断方法,难以适应快速诊断的要求。近年来,胶体金免疫层析技术以其快速(仅需几分钟)、准确(特异性强、灵敏度高)、简便(不需要昂贵仪器和专业人员)、肉眼判读、实验结果易保存等优点,为动物疫病诊断技术提供了新的模式,是未来动物疫病诊断的一个发展方向。相信随着新的标记物和制备方法的发展、标记技术的日趋成熟、单克隆抗体技术和分子生物学技术的广泛应用,胶体金免疫层析技术将会有更为广阔的应用前景,实现更加理想的价值,从而促进我国畜牧兽医事业的健康、快速和持续发展。

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Application of Gold Immunochromatography Assay in Animal Disease

ZU Li-chuang1,WANG Jin-liang2,LI Jiao1,SHEN Zhi-qiang1,2

(1.Shandong Lvdu Bio-Sciences&Technology Co.Ltd.,Binzhou,Shandong,256600,China;2.Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy,Binzhou,Shandong,256600,China)

Gold immunochromatography assay technology is a new immunoassay technology developed on the basis of gold labeling technique,immunological diagnosis techniques and chromatography analysis techniques.This immunological diagnostic technique is widely used in animal disease diagnosis because of it's simple,rapid,non-polluting,without special equipment,specific,sensitive and intuitive to judge the results.Gold immunochromatography assay technology can be used for the diagnosis of viruses in animals,bacteria,parasites of aquatic animals,and will play an increasingly important role.In this paper,gold immunochromatography assay for diagnosis of animal diseases was reviewed.

gold immunochromatography assay;animal disease

S851.4

B

1007-5038(2010)08-0101-05

2010-01-25

祖立闯(1981-),男,黑龙江人,硕士,主要从事从事动物病毒学研究。*通讯作者