Geminin在细胞周期中的作用研究进展

周叶萍综述,舒茂琴审校

(第三军医大学西南医院心血管内科/重庆市介入心脏病学研究所,重庆400038)

Geminin在细胞周期中的作用研究进展

周叶萍综述,舒茂琴审校

(第三军医大学西南医院心血管内科/重庆市介入心脏病学研究所,重庆400038)

Geminin;细胞分裂周期蛋白-10依赖性转录因子;细胞周期;再复制

随着生物学的飞速发展,关于细胞周期调控的研究越来越受到人们的关注。对细胞周期相关因子 Geminin(起始特许阻遏子)的研究已成为热点。Geminin是一种定位于核内的小分子蛋白,具有相对复杂的结构模式,预示着它的功能多样性。它通过调节细胞周期时相中的重要事件作用于细胞增殖;经多种途径参与DNA复制的调节;抑制中心体重复复制[1];推进G2/M期和维持正常胞质分裂等;调节胚胎发育,尤其是神经的发生,还可以与同源异型盒蛋白或是基因相互作用,在细胞增殖与分化中发挥协调的功能,近年研究还发现它可能具有癌基因功能,而且随着研究的深入和对 Geminin功能的更多的发掘,该蛋白的功能将被进一步地阐明。现对 Geminin蛋白结构、功能、调控机制及其在细胞周期中作用的研究进展做一综述。

1 Geminin的结构及定位

Geminin是一种多细胞生物蛋白,相对分子质量为25 klD,由 Geminin基因编码,存在于细胞核内[2],但不存在于酵母中[3]。有研究于1998年在非洲蟾蜍卵的有丝分裂期中,从cDNA编码的蛋白选择性地降解提取物中发现了 Geminin,它有2种异构体——GemininH和 GemininL,分别含有 219和216个氨基酸。通过检测 Geminin氨基酸序列已经鉴定出了几个结构基序[4]。

分辨率为17.5A的电子显微镜揭示了人类 Geminin蛋白三维图[5]:头代表 Geminin的N末端,中心体对应卷曲螺旋结构域,颈代表阻止DNA再复制区域。N末端为泛素化的位点。Geminin中心部位氨基酸序列能够形成一种可变的卷曲螺旋(coiled-coil)结构域,该种结构域通常与蛋白质二聚体相关[6],能与细胞分裂周期蛋白-10依赖性转录因子(cdcl0 dependent transcriptl,CDT1)牢固结合[7]。晶体学揭示了 Geminin 3个可能与CDT1结合的区域[8]:(1)暴露的带负电荷的谷氨酸根对于与CDT1静电相互作用是必需的;(2)N末端的卷曲螺旋结构域增加了10个可以结合到中心区域的上游基团;(3)N末端可变的卷曲螺旋结构域可以和CDT1N末端100个氨基酸相结合。

2 Geminin与细胞周期

细胞周期划分为 G1期和S期,G2期和M期4个时相,进入增殖周期的细胞只有在各个时相中准确地完成相应事件,才能确保增殖周期的顺利进行。在 G1期早期,细胞分裂周期蛋白-6(cell division cycle-6,CDC6)的表达水平一过性升高,与起始识别复合物((origin recognition complex,ORC)结合在一起,之后微小染色体维持蛋白(minichromosome maintenance,MCM)形成环状复合物,位于细胞核中的 CDC6协同促进MCM环状复合物加载于染色质上,使其结合到复制原点邻近的DNA上,这样完整的具有活性的前复制复合物(Pre-RC)装备完成,DNA开始复制[9]。

研究证明,Geminin在细胞周期的各时期中发挥着不同的调控作用,其作用方式也不一样。它是 G1期向S期转化的起始信号,在S期开始增加,在M期达高峰,在下一个 G1期到来前降解[10]。在M期:分裂后期促进复合物(APC)活性增强,诱导 Geminin基因的“破坏盒”发生突变,水解 Geminin蛋白。Geminin从M期降解后,促使DNA复制的启动,因此,Geminin对DNA复制启动是非常重要的,直到细胞分裂完成;S期:它能连接CDT1并使之失活,确保DNA在复制完后不发生再复制;Geminin通过与CDT1结合使之失活,从而阻止Pre-RC的完整性及稳定性,妨碍MCM加载到染色体上,造成DNA复制启动的停止。在S期起始阶段,Geminin开始在核内聚集。Geminin二聚体而不是单体在胞浆内与游离的CDT1紧密结合,从而阻止S期Pre-RC的形成[9],而且 Geminin的卷曲螺旋结构域C端通过位阻阻断了MCM家族装载到CDT1的通路[11-12]。核内 Geminin蛋白从S期到 G1期一直维持到有丝分裂期末[13],然后,经过一系列不同的可能系种族特异性途径来灭活,而这种灭活机制对于游离CDT1的存在及准许下一轮DNA复制是必需的。

肿瘤细胞和正常细胞的增殖遵循同样的细胞周期,但是调控机制不同。关于导致癌症最常见的说法是 G1、S或 G2期检查点的功能障碍。Geminin保证了适当的复制及通过S期,因此它被推断为一种肿瘤抑制物,而不是致癌基因,然而表达分析却显示在肿瘤组织或变异细胞中 Geminin表达上升[14]。在散在的非浸润性乳腺癌中,Geminin水平与肿瘤分期有关[15]。在乳腺癌早期,Geminin表达就已经升高,而且过表达预示着肿瘤转移及预后不良[14]。在直肠癌,Geminin水平随着放化疗的进行而下降,最近已经有实验研究把 Geminin作为肿瘤转移及肿瘤发生的分子标记。

3 G eminin与CDT1之间的平衡

细胞周期里的相关蛋白水平的定量变异要求精密的调控机制,这些机制的阐明将有助于进一步了解在肿瘤发生中Geminin与CDT1的作用原理。Saxena和Dutta[16]用体DNA复制分析方法证实了 Geminin作用的靶体是CDT1:(1)Geminin与CDT1结合;(2)CDT1的降解和 Geminin过度表达都能有效阻止复制进行;(3)CDT1的过度表达可以使被 Geminin阻止的复制再次进行。这表明 Geminin通过CDT1发挥抑制细胞周期的作用。两者结合后使CDT1失活,从而阻止 Pre-RC结构的完整性及功能的稳定性,妨碍MCM加载到染色体上,造成MCM复制启动的停止。由此可见这对矛盾体间的平衡对基因稳定起着重大的作用[17]。在体细胞的细胞周期里,Geminin与CDT1蛋白水平是可以互补的[13,18]。一项最新研究证明 Geminin-CDT1复合体在复制起点作为分子开关,能够阻止DNA复制的启始,并能将MCM解链酶加载到染色质上[19]。因此,Geminin只有在进入 S期之前再活化,且与CDT1两者之间达到一种恰当的比例时它才能抑制CDT1的活性[18]。有研究显示在DNA复制准许期间,先被征募到染色体的 Geminin与CDT1形成复合物装订到染色体,与MCM2-7复合物相互作用,准许染色体在每一细胞周期复制1次。另一方面征募额外的 Geminin抑制CDT1-Geminin复合物的活性预防再复制发生。在人类细胞Geminin在G2-M期允许CDT1聚集起积极作用;在S-G2期阻止DNA复制准许的启动。因此,在快速分裂细胞和癌细胞中也有 Geminin高水平的表达[20]。更为重要的是,Geminin翻译后调控[21]可能对于它能够在不同的状态间迅速转化是极其关键的[19]。

4 Geminin蛋白水平的试验性调节

被高度控制了的细胞周期调控因子水平的平衡,能够被获得或失去功能途径而试验性地扰乱。向果蝇体内注射 Geminin的非降解形式-mRNA或是通过 Ga14/UAS系统错误表达Geminin,都能有效地阻碍 Pre-RC的装配[13,22],然后MCM蛋白的装载被抑制,而染色质与ORC的结合却未受影响[13]。这种复制的阻断作用可以通过过量的CDT1表达而得以有效地复苏[9,22]。野生型的 Geminin瞬间过表达不能产生主要效应,也不能阻止细胞周期进行[9]。然而在稳定转染后却可以观察到在S期增殖和聚集起来的细胞荧光放射增强。在培养细胞中,随着 Geminin的稳定表达,可以观察到更多的变化。这种效应有赖于内皮 Rb蛋白的存在[22]。HCT116(结肠癌细胞)(Rb+)可以表达与生理水平相似的稳定形式的 Geminin,因此可以阻止增殖并启动DNA损伤检查点途径,但是无凋亡[22]。在过度表达试验中,这种表型能够通过相应升高的CDT1所复苏。在裸鼠体内,移植包含非降解 Geminin可以产生较少的肿瘤形式[14]。单独过表达CDT1能够产生重复复制,基因不稳定性及恶性转移[15]。通过反义技术试验性下调 Geminin水平,如显性负相途径、免疫耗竭、RNAi、siRNA或遗传突变用于促进细胞分裂[22-23]。Hela细胞在耗竭 Geminin后不会出现染色体破损、断裂或死亡,也没有重复制发生,可能与CDT1在S期被有效地遍在蛋白化及蛋白水解作用有关[24]。由此可见,似乎 Geminin仅仅是在细胞被剥脱了其他调控机制的情况下对于控制正常的细胞周期进程是非常必要的。

5 展 望

严格的DNA复制对于保证细胞周期中染色体的适当的复制与分离是必需的。细胞周期调控异常可导致基因不稳定性及细胞恶性增殖。Geminin作为参与细胞增殖周期调控的重要细胞周期相关因子,对它的生物学特性正进一步深入地认识。越来越多的报道指出,Geminin具有连接细胞增殖和胚胎分化的功能,但关于 Geminin这种“仲裁者”作用的详细信息尚不明确。如Geminin与同源异型盒蛋白到底是怎样作用的?同源异型盒蛋白与CDT1竞争的重要性在哪里?Geminin在神经发生的不同阶段和不同空间内的作用是怎样定位的?作用时间如何选择?Geminin与肿瘤的关系?这些问题有待更多的实验探索去解答[25]。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2010.24.063

R329.28

A

1671-8348(2010)24-3432-03

2010-06-13

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