牛羊肉中三聚氰胺的HPLC快速检测

李巧玲，安 源，张艳川，杨 金

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.长春大学生物科学技术学院，吉林 长春 130012)

牛羊肉中三聚氰胺的HPLC快速检测

李巧玲1，安 源2，张艳川1，杨 金1

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.长春大学生物科学技术学院，吉林 长春 130012)

建立高效液相色谱(HPLC)检测牛、羊肉中三聚氰胺的检测方法。样品经1%三氯乙酸-乙腈(3:1，V/V)提取，利用阳离子交换固相萃取柱净化后，洗脱液于50℃条件下用氮气吹干，残渣用离子对试剂缓冲液-乙腈(90: 10，V/V)溶解，用高效液相色谱法由紫外检测器检测、外标法定量。结果表明，三聚氰胺在0.2～80μg/mL质量浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数(R2)为0.9999，其检出限为0.05mg/kg。在牛肉样品中，三聚氰胺的平均回收率为81.73%～83.35%，相对标准偏差为0.97%～1.95%；在羊肉样品中，三聚氰胺的平均回收率为80.95%～82.95%，相对标准偏差为0.70%～2.32%。本方法具有操作快捷、灵敏度高、重现性好等优点。

三聚氰胺；牛肉；羊肉；高效液相色谱

从“宠物饲料事件”到“三鹿问题奶粉事件”，再到“鸡蛋中检出三聚氰胺”，三聚氰胺已经成为食品公共安全的焦点[1-3]。三聚氰胺(melamine)是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。由于其含氮量高达66%，换算成粗蛋白含量为416.27%[4]，在“凯氏定氮法”中可以表现出“高蛋白质含量”的假象，所以成了“三鹿奶粉”事件中的主角。

关于三聚氰胺对人的毒性报道较少，大部分是动物研究的结果。三聚氰胺的毒作用靶器官为膀胱和肾脏，实验显示14C标记的三聚氰胺进入Fischer344大鼠体内后主要分布于血液、肝脏、肾和膀胱等器官[5-7]。三聚氰胺既然能进入血液，推测其也能通过代谢在肉组织中有残留。既然有残留，残留量能否对摄入该肉的人体产生危害，就成为一个很值得关注的问题。既然鸡蛋中能检出残留的三聚氰胺[3]，推测食饲料的动物的肉中也有可能检出三聚氰胺。

2008年10月7日国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会批准发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》国家标准(GB/T 22388—2008)，标准规定了高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法3种方法为三聚氰胺的检测方法，检测定量限分别为2、0.05、0.01mg/kg[8]。目前，对于鲜肉中三聚氰胺残留的检测研究报告还较少[9]，因此本研究在GB/T 22388—2008的基础上，通过对样品前处

理方法进行改进，研究牛、羊肉中三聚氰胺的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

牛、羊肉购买于超市。

三聚氰胺标准品(纯度大于 99.0%) 河北省食品质量监督检验研究院；甲醇、乙腈、辛烷磺酸钠(均为色谱纯)；柠檬酸、三氯乙酸(均为分析纯)；实验用水均为超纯水；氮气(纯度大于99.999%)；0.2μm有机相微孔滤膜 天津市沃尔孚科技发展有限公司。

LC-20A高效液相色谱仪(配有SPD-20A检测器和LC solution工作站) 日本Shimadzu公司；AL204分析天平 梅特勒-托利多有限公司；XYJ-3台式自动平衡离心机 春兰实验仪器厂；SK5200LHC超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；氮气吹干仪 上海济成分析仪器有限公司；ProElut阳离子交换固相萃取柱 Dikma科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

甲醇水溶液、三氯乙酸溶液(1%)、氨化甲醇溶液(5%)、离子对试剂缓冲液以及三聚氰胺标准储备液的配制见参考文献[8]。

1.2.2 标准曲线的绘制

用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的质量浓度为0.2、0.8、2、20、40、80μg/mL的标准工作液，各取20μL上色谱仪进样分析。以标准样品的质量浓度为横坐标、相应的峰面积为纵坐标，获得三聚氰胺的标准曲线及相关系数。

1.2.3 样品的处理

选取新鲜牛肉、羊肉样品约500g，分别切碎后，装入洁净盛样袋内，密闭并标识，冷冻于冰箱中。

取适量上述样品于干净的研钵中，研磨成浆状后称取2g(精确至0.01g)试样于50mL具塞塑料离心管中，加入12mL 1%三氯乙酸溶液和4mL乙腈，超声提取8min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经1%三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，残渣再经上述过程提取一次，然后合并滤液，用1%三氯乙酸溶液定容至35mL，移取7mL滤液，加入7mL水混匀后转移至固相萃取柱中。依次用3mL水、3mL甲醇和6mL氨化甲醇溶液洗脱。洗脱液于50℃条件下用氮气吹干，得0.4g残留物，用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

1.2.4 液相色谱条件

色谱柱为Shim-pack VP-ODS C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为离子对试剂缓冲液-乙腈(90:10，V/V)，检测波长240nm，流速1.0mL/min，柱温40℃，进样量20μL。

1.2.5 三聚氰胺含量的计算

试样中三聚氰胺含量的计算参见参考文献[8]中的计算公式。

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

根据GB/T 22388—2008相关资料，选取1%三氯乙酸-乙腈溶液(3:1，V/V)为提取剂。精确称取2g供试样品并添加三聚氰胺标准溶液(1μg/mL)250μL于干净的研钵中，研磨成浆状后放入50mL塑料离心管中，加入16mL提取剂高速均质2min，后面的操作步骤和1.2.3节相同，高效液相色谱的测定结果见表1。

表1 以三氯乙酸-乙腈为提取剂三聚氰胺的回收率Table 1 Recovery of melamine in mutton and beef extracted with a mixture of trichloroacetic acid and acetonitrile mixture (3:1，V/V)

从表1可以看出，1%三氯乙酸-乙腈溶液对于两种样品中三聚氰胺的提取效果比较好，所以确定本实验的提取剂为1%三氯乙酸-乙腈溶液。

2.2 提取液净化条件的选择

在三聚氰胺的检测分析实验中，固相萃取法是最为常用的净化方法。萃取柱常使用以高聚物为基质的亲水-亲脂混合型阳离子交换柱，苯磺酸基属于强阳离子交换功能团，在任何pH值条件下都为带负电荷的阴离子[10]。因此，只要控制样品溶液的pH值使三聚氰胺呈阳离子状态，就能够被苯磺酸基通过离子交换方式吸附。在样品溶液中，三聚氰胺已经是在酸性条件，故本实验采用ProElut阳离子交换固相萃取柱(基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物)净化提取液，结果表明，其净化结果较为理想。

2.3 分析的线性范围和检出限

40μg/mL三聚氰胺标准溶液的HPLC图见图1，三聚氰胺的标准曲线见图2。

由图2可看出，三聚氰胺在0.2～80μg/mL的质量浓度范围内呈良好线性关系，线性相关系数R2为0.9999。

依据本实验的色谱条件，将标准溶液进行连续稀释，同供试样品进行研磨、提取、净化后进样分析，根据3倍噪音的峰面积响应值和方法回收率，可以得到最低检出限[11]。测定表明，三聚氰胺的检出限为0.05mg/kg。此数值小于国标《原料乳与乳制品中三聚

氰胺检测方法》中高效液相色谱法的检测定量限2mg/kg，完全可以满足对肉中三聚氰胺残留的分析。

图1 40 μg/mL三聚氰胺标准溶液的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of melamine standard solution at 40 μg/mL

图2 三聚氰胺的标准曲线Fig.2 Standard curve of melamine

2.4 回收率的测定

本实验分别取2g牛肉、羊肉样品各3份，在2、4、8μg/g三个添加水平，按前述提取方法及检测条件分别测定，同时做空白样品两份，每份样品监测6次，确定添加回收率。测得的回收率和相对标准偏差如表2、3所示。结果表明，牛肉样品在3个添加水平下，样品中三聚氰胺的平均回收率为81.73%～83.35%，相对标准偏差为0.97%～1.95%；羊肉样品在3个添加水平下，三聚氰胺的平均回收率为80.95%～82.95%，相对标准偏差为0.70%～2.32%，这说明该方法的准确度和精密度良好。

表2 牛肉测定的回收率(n=6)Table 2 Average spike recoveries (6 replicates) for melamine in beef at 3 levels

表3 羊肉测定的回收率(n=6)Table 3 Average spike recoveries (6 replicates) for melamine in mutton at 3 levels

2.5 牛、羊肉中三聚氰胺含量的测定

图3 牛肉样品的高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of a beef sample

图4 羊肉样品的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of a mutton sample

由图1可知，三聚氰胺的保留时间在13.5min左右。图3、4同图1对比可知，牛肉样品中含有三聚氰胺，羊肉样品中不含有三聚氰胺。根据参考文献[8]的计算公式，计算得出牛肉样品中三聚氰胺的含量为1.064mg/kg，并且在待测物出峰的区域内，未见干扰峰出现。根据国家含乳15%以上食品中三聚氰胺的限量值(2.5mg/kg)的规定，牛肉样品中虽然检出了三聚氰胺，但含量符合国家规定限量值。

牛肉样品中检出了三聚氰胺，而羊肉样品中未检出，分析原因可能为：牛和羊所食饲料有差异，羊吃的饲料中三聚氰胺的含量很少，或者饲料中不含有三聚氰胺，经机体代谢后，残留在肌肉组织中的三聚氰胺

的量低于仪器的检出限。

3 结 论

实验证明三聚氰胺能够通过饲料进入动物体内，并在肌肉组织中有残留，但其残留量较少，符合国家规定限量值，食用这种肉不会对健康带来危害。同时该研究也表明，用高效液相色谱检测牛羊肉中的三聚氰胺的含量是可行的。该方法精密度好，准确度高，检出限低，该研究为鲜肉中三聚氰胺残留的检测提供了切实可行的技术手段，推广性较强。

[1]宫靖, 吴燕. 宠物饲料加三聚氰胺成毒粮引发中美贸易风波[J/OL].财经, 2007, 186(11) (2007-05-28)[2008-09-12]. http://finance.qq.com/ a/20080912/002595_1.htm.

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[11]朱明华. 仪器分析[M]. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2007: 44.

Rapid HPLC Determination of Melamine in Beef and Mutton

LI Qiao-ling1，AN Yuan2，ZHANG Yan-chuan1，YANG Jin1
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. Biological Scientific and Technical College, Changchun University, Changchun 130012, China)

A rapid HPLC method was developed for the determination of melamine in beef and mutton. Samples were extracted with a mixture of trichloroacetic acid and acetonitrile mixture (3:1，V/V) and cleaned up on a cation exchange solid-phase extraction (SPE) column. The eluate was blown to dryness under nitrogen at 50 ℃ and then dissolved in a mixture of ion-pair buffer and acetonitrle (90:10, V/V). The analysis was carried out using HPLC with UV detector. A good linear relationship was observed for melamine within the range of 0.2－80 μ g/mL and the linear correlation coefficient (R2) was 0.9999. The limit of detection was 0.05 mg/kg. For beef, average spike recoveries (6 replicates) at 3 levels ranged from 81.73% to 83.35%, with a relative standard deviation (RSD) from 0.97% to 1.95%. For mutton, average spike recoveries (6 replicates) at 3 levels ranged from 80.95% to 82.95%, with a RSD from 0.70% to 2.32%. The method proved to be rapid, accurate and reliable.

melamine；beef；mutton；high performance liquid chromatography

TS251.7

A

1002-6630(2010)10-0196-04

2009-08-07

教育部“留学回国人员科研启动基金”资助项目(教外司留[2009]1001号)

李巧玲(1973—)，女，副教授，博士后，研究方向为食品安全与检测。E-mail：lql98119@126.com