秸秆糖化复合菌系的筛选方法及糖化效果评价

刘 冰，徐诚蛟，王爱杰

(1.哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，哈尔滨150090，waj0578@hit.edu.cn; 2.沈阳农业大学土地与环境学院，沈阳110866;3.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030)

从19世纪70年代的石油危机开始，利用有机废物产生生物质能被认为是一个重要的产能途径［1］.我国是农业大国，每年产生大量纤维素类的农业废弃物，利用生物手段将其转化为高附加值的生物质能成为研究热点［2］.其中，降解纤维素产糖是这项研究的核心内容之一［3－5］.在人们追求糖产量的同时，如何能更准确的将产出的糖量测定出来成为一个热点问题.由于在复合菌系内，微生物对还原糖利用的瞬时性，通过测定反应体系中残留的还原糖量，很难准确的评价其糖化能力.本试验采用分室同步糖化发酵产氢的培养模式，将从高温堆肥中筛选得到降解水稻秸秆的复合菌系，与实验室原有只能代谢单糖高产氢菌株YUAN-3(Ethanoligenens harbinense)［6］分室同步糖化发酵培养，以单独利用葡萄糖为底物发酵时，产生氢气与所消耗葡萄糖的比例关系为对照，研究同步培养时复合菌系降解秸秆产生还原糖的能力，从而对厌氧纤维素降解菌系生物糖化效果进行评估.

1 材料与方法

1.1 菌种来源与培养基配制

复合菌系分离样品取自高温牛粪堆肥.实验室原有菌株YUAN－3(E.harbinense)，该菌株有较强的产氢能力，同时又具备自凝集特性，该菌仅能利用单糖产氢.试验所需培养基分别为:秸秆培养基(L－1):NH4Cl 1.0 g，K2HPO43.5 g，KH2PO41.5 g，MgCl20.5 g，NaCl 1.0 g，KCl 0.2 g，半胱氨酸0.5 g，蛋白胨2.0 g，酵母粉2.0 g，秸秆 5 g，维生素液［7］5 mL，微量元素溶液［7］1 mL，刃天青1.5 mg，pH 7.0.YUAN-3培养基［8］.滤纸液体培养基［9－10］.将各种培养基分装于血清瓶内，全过程在氮气的保护下进行，121℃，20 min高压灭菌.

1.2 产糖复合菌系的富集与筛选

1.2.1 复合菌系的富集

取高温堆肥样品10 g，在氮气保护下，投入装有数颗玻璃珠的无氧无菌水中，在振荡器中振荡1 h，利用玻璃珠剪切力将堆肥样品粉碎，使微生物菌体充分分散于体系中.再将混合体系接种于秸秆培养基中，接种量10%，35℃静止富集培养10 d，连续转接两次，使降解纤维素菌株大量富集.

1.2.2 秸秆降解效果

采用滤纸崩解法.将富集得到的菌群接入到滤纸培养基中培养，滤纸在配制培养基前需烘干恒重后称重，接种量为10%，35℃、120 r/min振荡培养，7～10 d后，烘干称重，测量滤纸的崩解情况.反复转接3次，比较滤纸崩解的效果.

1.2.3 连续稀释转接筛选高产糖复合菌系

将筛选得到的利用滤纸效果好的菌系用无菌水进行梯度稀释，取稀释度为10－3～10－9的溶液分别接种到水稻秸秆培养基中，35℃培养箱培养.每隔24 h小时取样，采用DNS比色法［11－12］测定还原糖量.总结数据，当还原糖量升高，及时将该稀释度培养体系再度稀释至10－3～10－9，分别接入到新鲜秸秆培养基中液体培养，如此连续稀释以得到高产糖复合菌系.

1.3 产糖效果评价方法及装置

为更好的研究降解纤维素复合菌系的产糖效果，将其与已知菌株YUAN－3进行分室同步糖化发酵，根据复合菌系与YUAN－3分别培养时，产生单位体积H2时的底物利用率，研究分室同步培养条件下复合菌系的产糖效果.将筛选得到产糖效果较好的复合菌系接种于如图1所示反应器的A室，B室接种YUAN－3，A、B两室以0.45 μm细菌滤膜分隔，单室容积32 mL，装液量80%，以添加于A室的水稻秸秆段为惟一碳源，流加无碳源培养液，采用单批培养方法，以分别单室培养为对照，测定反应器A、B室及对照产氢量变化规律，对照的葡萄糖消耗量，反应体系内还原糖含量残留量.氢气测定、发酵液相末端代谢产物的测定采用美国安捷伦7890型气相色谱仪测定.色谱柱:TDX－02;柱温:100℃;汽化室:80℃;检测器100℃.

图1 双室反应器装置简图

1.4 复合菌系糖化能力计算与秸秆降解率测定

分别测定复合菌系和YUAN－3在单室反应器中，累积产氢量与葡萄糖消耗量，并根据两者的比例关系拟合成回归曲线方程.再将双室反应器中复合菌系和YUAN－3的产氢量分别代入方程，求得不同时间产生一定体积的氢气，所需消耗的还原糖量，以此来表述复合菌系降解秸秆的产糖效果.秸秆降解率=(原始秸秆质量－残留秸秆质量)/原始秸秆质量×100%.

2 结果与讨论

2.1 复合菌系的富集结果

富集得到的复合菌系JY在水稻秸秆培养基中能够生长，说明具有降解纤维素能力.分别观察其在滤纸培养基中培养7，9，11 d后的滤纸崩解程度，通过培养观察得到，图2中复合菌系JY在第11天能将滤纸完全降解成糊状，说明其具有较好利用纤维素底物的能力.

图2 滤纸崩解效果

2.2 筛选到的复合菌系及其产糖效果

将复合菌系 JY进行梯度稀释后接种于50 mL秸秆培养基，每天测定反应体系内还原糖产量，当产糖量升高时，说明利用秸秆的厌氧产糖微生物活跃，及时稀释转接，如此反复，从而得到产糖量较高的复合菌系.从表1看出，在稀释培养后的第2天，所有稀释度还原糖量均有所下降，下降最快为JY6(JY稀释为10－6)，而在第3天其还原糖量又迅速上升，达到0.088 5 mg/mL.此时将JY6再进行梯度稀释转接，转接后的第2天，JY66(JY6稀释为10－6)还原糖含量迅速上升达到0.148 6 mg/mL.再将JY66再进行梯度稀释，同样在转接后的第2天，JY665(JY66稀释为10－5)的还原糖含量上升达到最高值0.165 6 mg/mL，而后还原糖量开始下降.由此可见，通过测定还原糖量并及时稀释转接，可以将复合菌系的微生物结构向产糖微生物更活跃，产糖效率更高的方向驯化.得到一个降解纤维素产糖能力较强的菌系，并且产糖量会在接种后的第2天达到最大值.结果还表明，稀释度10－5或10－6对复合菌系内的产糖类群具有较好的分离度，即产糖微生物类群占所在菌系的比例较高，而随时间推移，产生的还原糖很快会被其它微生物类群利用，还原糖含量随即下降.

2.3 复合菌系的产糖效果评价

利用DNS法只能测得体系中残留的少量还原糖，无法反应菌系降解秸秆过程中，产生还原糖的量和变化动态.本研究利用同步分室培养的方法，利用反应器中氢产量来推算菌系降解秸秆产糖能力.

将产糖效果较好的复合菌系JY665接种于双室反应器A室，将菌株YUAN－3接种于B室，以利用单室反应器分别培养JY菌系和YUAN－3作为对照，35℃下振荡培养80 h.将JY复合菌系和YUNA－3对照产氢体积(ml)对消耗葡萄糖的质量(g)拟合方程，分别为Y=－0.000 5x2+ 0.012 1x+0.011 3(R2=0.934 3)和Y=－0.000 07x2+ 0.006 4x+0.001 3(R2=0.999 6)，且拟合度较高(如图3).

图3 产氢量对葡萄消耗量拟合曲线

图4 反应器产氢气变化动态

双室反应器JY复合菌系和YUAN－3，80 h累积产氢气量如图所示，80 h时产气累积量达到最大值分别为9.45 mL和14.40 mL.其中JY复合菌系产气量稳步上升，而YUAN－3则呈波动上升，可能是由于还原糖透过细菌滤膜时不均匀扩散造成的.YUAN－3的产氢起始时间为20 h，而JY复合菌系为32 h，说明由于JY的菌系复杂性使还原糖被消耗而产氢起始时间滞后.将反应器双室所产生氢气量(图4)代入JY复合菌系和YUNA－3对照的回归曲线方程，得到反应体系内还原糖消耗量的变化值，并与利用DNS法测得的反应器残留还原糖值进行对比.

结果(图5)表明，JY复合菌系和YUAN－3在发酵过程中所消耗的还原糖量在不断升高，在80 h时达到最大值，分别为0.081 0 g和0.083 8 g，总还原糖消耗量达到了0.164 8 g.水稻秸秆添加量为0.320 0 g，培养结束后水稻秸秆残留为0.124 6 g，据此JY复合菌系，产糖能力达到0.515 0g/g秸秆，秸秆降解率达到61.06%.

图5 反应器产生及残留还原糖量

同时，利用DNS法测定了反应体系中的残留的还原糖量，反应器内JY复合菌系和YUAN－3还原糖含量均较低，最高值也分别只有3.310 mg和3.005 mg，且动态变化并不规律.结果表明，在秸秆降解的过程中，可能还原糖在产生后便被及时利用，很难在反应体系发现糖的残留.由此可见，以产生一定体积氢气所消耗的葡萄糖量，来表述复合菌系降解秸秆产生的还原糖量是可行和有效的.

3 结论

1)利用连续稀释转接法，筛选得到能够降解水稻秸秆产糖的复合菌系JY665，该菌系35℃条件下降解纤维素产糖效果较好.将所得菌系JY665与产氢菌YUAN－3分室同步糖化培养，以单独培养时氢气产量对还原糖消耗量拟合曲线方程，代入反应器产氢量得到复合菌系产糖能力达到0.515 0 g/g秸秆，秸秆降解率达到61.06%.

2)通过拟合产氢体积与消耗葡萄糖量之间的曲线方程，采用分室同步糖化发酵法，以反应体系产氢量推知降解秸秆产生还原糖量，建立了一套关于复合菌系产糖能力的间接评价方法，并验证了该方法的可行性.

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