产酱香细菌中高活性纤溶酶菌株的筛选

林 芬，谢 和*

(贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

产酱香细菌中高活性纤溶酶菌株的筛选

林 芬，谢 和*

(贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

以酱香型酒生产所使用的高温大曲、酒糟、窖泥为样品，经分离筛选获得24株产酱香结果优良的细菌及16株产酱香结果较好的细菌。对产酱香细菌进行纤溶酶活性筛选，得到一株高产纤溶酶菌株GZJSⅠ-2，经初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，测得其发酵液酶活力(相当尿激酶酶活力单位)为1479.11U/mL，酶比活力为21751.62U/mg。以pH7.4的生理盐水作阴性对照，以尿激酶作阳性对照，在体外研究菌株GZJSⅠ-2发酵液上清液的抗凝集和血栓溶解作用，结果表明该菌株发酵上清液具有显著的体外血栓溶解作用，及一定的抗凝血效果，具有潜在的应用价值。

产酱香细菌；筛选；纤溶酶；分类；鉴定

酱香是一种传统香型，历史悠久，应用非常广泛，在食品、制酱、酿酒等方面都得到了很好的应用，尤其在酿酒方面。酱香型白酒也因具有优雅、独特的酱香味而闻名遐迩。酱香型白酒香味物质的产生、风格形成是美拉德反应的结果，而产酱香细菌所产生的生物酶，对美拉德反应及香味物质形成起了决定性的作用[1-3]。因此，酱香风味的形成与细菌有密切的关系[4]。

血栓性疾病是当前危害人类健康，导致死亡率最高的原因之一。治疗血栓栓塞类疾病目前最为有效并且可靠的方法是溶栓疗法。然而，传统溶栓药物如尿激酶、链激酶等具有半衰期短、易出血、口服无效等缺点。自1987年日本学者须见洋行等[5]首先发现微生物纤溶酶具有纤溶活性以来，由于微生物所产的纤溶酶来源广泛、易于大规模工业化生产，并且具有无毒副作用、体内半衰期长、成本低廉等其他溶栓剂所不具备的特点，受到各国科学家的广泛关注和深入研究。现已证明，微生物纤溶酶极有可能成为一种预防血栓栓塞类疾病的优良保健食品和药物。目前已经有很多学者分别从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[6]、根霉(Rhizopus sp.)[7]、米曲霉(Aspergillus oryzae)[8]、蛹虫草(Cordyceps militaris)[9]、黄绿蜜环菌(Armillaria)[10]等中发现纤溶酶。本研究从产酱香细菌中筛选高产纤溶酶的菌株，在国内外文献中尚未见报道，该菌的筛选鉴定将为下一步进行诱变、提高其产酶能力、微生物纤溶酶的产业化开发及微生物纤

溶酶高效表达基因工程菌的构建打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

产酱香参照菌株：枯草芽孢杆菌B1⑥(Bacillus subtilis B1⑥)由贵州大学微生物教研室分离并保存；不产酱香参照菌株：枯草芽孢杆菌10075(Bacillus subtilis 10075)为中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)保藏菌株。

1.2 材料与试剂

贵州茅台酒厂、习酒厂、怀庄酒厂等贵州省11家酒厂的酒曲、酒糟、窖泥等34个样品；家鸡购于贵阳医学院。

尿激酶(1280U/支) 中国药品生物制品鉴定所；凝血酶(200U/支)、纤维蛋白原(1g/瓶) Sigma公司；牛血清白蛋白(5g/瓶) Solarbio公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器与设备

WFZ UV-2000型紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；SHZ-82A气浴恒温振荡器 常州奥华仪器有限公司；2-16K高速冷冻离心机 Sigma公司；SHP-250型智能生化培养箱 上海光都仪器设备有限公司。

1.4 培养基

分离培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L、pH7.2～7.4，121℃，0.1MPa，灭菌30min；普通肉汤培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、pH7.2～7.4，121℃，0.1MPa，灭菌30min；产酱香筛选培养基：黄豆用水浸泡3～8h，去皮，分装三角瓶(25g/250mL)，121℃，0.1MPa，灭菌30min；产纤溶酶初筛培养基：脱脂奶粉50g/L(115℃灭菌20min)，琼脂15g/L(121℃，灭菌30min)，冷却至50℃左右混匀；种子培养基Ⅰ：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L、pH 7.2～7.4，121℃，0.1MPa，灭菌30min；种子培养基Ⅱ：葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、Na2HPO42g/L、NaH2PO41g/L、CaCl20.2g/L、MgSO40.5g/L、pH7.0，121℃，0.1MPa、灭菌20min；发酵培养基Ⅰ：葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、K2HPO42g/L、KH2PO41g/L、CaCl20.2g/L、MgSO40.5g/L、pH7.0，121℃，0.1MPa、灭菌20min；发酵培养基Ⅱ：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、Na2HPO42g/L、NaH2PO41g/L、CaCl20.2g/L、MgSO40.5g/L、pH7.0，121℃，0.1MPa、灭菌20min。

1.5 方法

1.5.1 菌株的分离

称取样品10g放入盛有90mL无菌水三角瓶中，充分振荡摇匀，再稀释成10-2～10-10不同稀释度的样品悬液，选择10-3至10-107个稀释度涂布于分离培养基平板中，37℃倒置培养24h。挑取单菌落经平板划线纯化，简单染色镜检为纯种后转接于营养琼脂斜面，37℃恒温培养24h，4℃冰箱保存备用。

1.5.2 产酱香菌株的筛选

将分离得到的菌株经两次活化后按体积分数20%接种于普通肉汤培养基，30℃、150r/min摇床培养24h，取400μL培养液接种于已灭菌的产酱香筛选培养基中，按30℃→35℃→40℃→45℃升温发酵各24h，发酵结束后由5人观察嗅闻评价。

1.5.3 产纤溶酶菌株的初筛

一次初筛：将筛选得到的产酱香菌株培养18h后点种于产纤溶酶初筛培养基中，37℃倒置培养48h，分别测量菌落直径(d)与透明圈直径(D)3次，计算平均值，D/d值表示菌株产蛋白酶能力的大小，将比值较大的菌株确定为二次初筛的出发菌株。

二次初筛：将已活化的出发菌株按体积分数20%接于种子培养基Ⅰ，37℃、180r/min摇床培养24h，按体积分数5%接种量转接于装有50mL发酵培养基Ⅰ的三角瓶(250mL)中，37℃、180r/min摇床培养36h，冷冻离心取上清液测中性蛋白酶活力[11]。

1.5.4 产纤溶酶菌株的复筛

挑取一环产纤溶酶初筛菌株，转接于装有50mL种子培养基Ⅱ的三角瓶(250mL)中，30℃、150r/min摇床培养24h，按体积分数4%接种量转接于装有50mL发酵培养基Ⅱ的三角瓶(250mL)中，30℃、150r/min摇床培养96h， 4℃、8000r/min、离心20min，取上清液10μL点样于纤维蛋白平板中。室温放置10min，再置于37℃恒温培养18h，测其溶解圈垂直直径，各测3次计算平均值，垂直直径的乘积为溶解圈的面积。溶解圈面积最大的菌株作为发酵生产纤溶酶的目的菌株。

1.5.5 纤溶酶活性的测定

参照文献[12]的方法，稍加修改。取质量浓度2g/100mL 琼脂溶液约10mL于直径9cm平板中，冷却凝固形成第一层。取质量浓度1g/100mL琼脂糖溶液10mL，3.72mg/mL纤维蛋白原溶液6.25mL，20U/mL凝血酶125μL，于50℃左右混匀，倒入平板形成第二层，室温放置至乳白色，用直径为3mm的打孔器打孔。分别取20、40、60、80、100U/mL尿激酶标准品10μL点样于上述平板的小孔中，37℃温育18h，测定溶解圈的垂直直径。根据报道[13]，溶解圈的两垂直直径之积(A)与酶浓度(c)有以下关系，A=K×c，所以以测定的不同酶浓度的溶解圈垂直直径乘积的对数对不同酶浓度标准品的对数作一元线性回归。根据尿激酶标准曲线计算样品发酵液纤溶酶活力。

1.5.6 蛋白质含量的测定

参照文献[12]测定标准曲线，利用蛋白质标准曲线计算样品的蛋白质含量。

1.5.7 产纤溶酶目的菌株的初步鉴定

参照文献[14]的方法。

1.5.8 抗凝血实验[15]

3支灭菌小试管，分别加1mL 0.9g/100mL NaCl(用0.005mol/L PBS，pH7.4配制)，发酵上清液，尿激酶100U/mL(0.9g/100mL NaCl配制，pH7.4)，然后再在每管加1mL新鲜鸡血血液，轻轻振荡、混匀，置37℃恒温水浴，定时观察、记录、拍照。

1.5.9 体外血栓溶解实验[15]

取新鲜鸡血血液，制成实验性血栓。将血栓切割成大致相等的若干份，称质量后分别加入灭菌的试管中，再分别加入1mL 0.9g/100mL NaCl(用0.005mol/L PBS，pH7.4配制)、发酵上清液(根据1.2.4节测定的酶活，用0.9g/100mL NaCl将其稀释至对照尿激酶的活性)、尿激酶100U/mL(0.9g/100mL NaCl配制，pH7.4)、然后置于37℃恒温水浴，分别于2、4、6h后取出试管，小心取出血栓，并用滤纸条轻轻吸干血栓表面水分后，依次称质量，计算血栓溶解率。

式中：m1为实验前血栓质量；m2为实验后血栓质量。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

采用分离培养基，从34个样品中经分离纯化共获得451株菌株，接于营养琼脂斜面4℃冰箱保存备用。

2.2 产酱香细菌的筛选

从451株细菌中筛选出产酱香细菌62株，其中24株产酱香结果优良，16株产酱香结果较好，22株微产酱香，结果见表1。

2.3 产纤溶酶菌株的初筛

62株产酱香的细菌均能不同程度产生蛋白酶，其D/d＞1.5。其中有20株产酱香细菌的D/d≥3.0，将其作为二次初筛的出发菌株。根据蛋白酶活力测定，确定酶活力较高的9株菌作为产纤溶酶筛选的出发菌株，结果见表2。

2.4 产纤溶酶菌株的复筛

由表3可见，9株产酱香细菌均有较高的纤溶酶活力，其中菌株GZJSⅠ-2产纤溶酶活力最高，溶解圈直径最大，其溶解圈面积为541.96mm2。纤维蛋白平板法测定的溶解圈见图1。

表1 产酱香菌株筛选结果Table 1 Screening results of Maotai-flavor strains

表2 产纤溶酶菌株初筛结果Table 2 Preliminary screening results of strains with fibrinolytic enzyme activity

表3 产纤溶酶菌株复筛结果Table 3 Secondary screening results of strains with fibrinolytic enzyme activity

图1 纤维蛋白平板法测定的溶解圈Fig.1 Transparent circle determination on a fibrin plate

2.5 高活性纤溶酶菌株GZJSⅠ-2的初步鉴定

2.5.1 菌落形态观察

普通琼脂营养平板37℃培养24h，菌株GZJSⅠ-2的单菌落为近圆形，白色，边缘不光滑呈波状，中央突起有褶皱呈火山口状，不透明，质地干燥，无光泽。在液体肉汤培养基中形成菌膜。

2.5.2 菌体形态观察

菌株GZJSⅠ-2革兰氏染色呈阳性(图2)，菌体为杆状，两端钝圆，长为1.88μm，宽为0.77μm；形成芽孢，芽孢偏端生，呈柱状，不膨大，长为1.15μm，宽为0.63μm。

图2 菌株GZJSI-2的革兰氏染色结果Fig.2 Gram staining results of strain GZJSI-2

2.5.3 生理生化鉴定

综合以上各项实验，并查阅《伯杰细菌鉴定手册》[16]及《常见细菌系统鉴定手册》[14]将菌株GZJSⅠ-2初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

表4 GZJSI-2菌株的生理生化特征Table 4 Biochemical and physiological properties of strain GZJSI-2

2.5.4 抗凝血实验

图3 抗凝血实验Fig.3 Anticoagulant effect of the fermentation supernatant of GZJSI-2

以生理盐水(0.9g/100mL NaCl)为阴性对照，尿激酶为阳性对照，用GZJSⅠ-2的发酵上清液进行抗凝血实验。结果发现：阴性对照最初就全部形成血栓，37℃恒温孵育，形成的血栓几乎没有变化；阳性对照最初仅形成了少量血栓，随着37℃恒温孵育，由于尿激酶的浓度很小，导致水分渗出，血栓逐渐萎缩，发生的血栓溶解速率很慢，溶液较清，含有极少的红细胞；GZJSⅠ-2的发酵上清液组最初形成了更少量的血栓，随着37℃恒温孵育，血栓逐渐变小直至完全消失(图3)。结果表明，GZJSⅠ-2菌株的发酵上清液具有明显的抗凝血作用。

2.5.5 体外血栓溶解实验

图4 血栓溶解率曲线Fig.4 Thrombolysis curves of the fermentation supernatant of GZJSI-2, urokinase and normal saline

由图4可见，生理盐水对血栓有轻微溶解作用，尿激酶和GZJSⅠ-2菌株发酵上清液都对血栓有明显的溶解作用，后者的血栓溶解作用略高于尿激酶。

3 讨 论

本实验从不同酒厂的酒曲、酒糟、窖泥中分离筛选出62株产酱香的细菌，通过酪蛋白平板法测定，这些产酱香细菌均具有相对较高的产蛋白酶能力。由此可见，蛋白酶是产酱香的必要条件。蛋白酶活力的大小可能是影响美拉德反应产酱香的一个重要因素，蛋白酶活力低，其分解蛋白产生的氨基酸就少，造成美拉德反应前体物质的缺乏，从而影响酱香风味的形成。这与邵元龙等[17]的研究结果一致。

血管堵塞所引起的心肌梗塞和脑梗塞，是当前临床死亡的主要原因之一。其病因是纤维蛋白聚集于动脉血管壁所导致。因此，研制高效、特异、安全、副作用小的溶血栓药物，一直是近年来全世界范围的热门课题。而微生物是获得溶栓药物的一个重要来源，国际上多采用分离的产纤溶酶菌株作为出发菌株，通过改良菌种和优化发酵参数、生产工艺等方法来提高微生物纤溶酶活性。国内微生物纤溶酶的研究主要是菌株筛选和发酵条件优化等，目前还没有微生物纤溶酶产品上市，主要原因是微生物纤溶酶单位发酵液中的酶产量低[18]。用野生型微生物进行液体发酵时的纤溶酶活力一般可达200～300U/mL，诱变优化后可达600～3000U/mL，最高可达5989U/mL[19]。本实验报道的菌株 GZJSⅠ-2发酵液的纤溶酶活力高达1479.11U/mL，与已报道的文献相比较[6-10]，属野生型高产纤溶酶菌株。并且该菌经黄豆发酵能产生较好的酱香风味，具有较高的产蛋白酶能力，属多功能菌株。因此，该菌不仅可为白酒酿造、酶制剂、药物、饲料、香料等产业提供丰富的生物资源，其较高的纤溶酶活性也为生产新型的溶血栓药物提供了参考。另外，可将发酵产生的酱香风味与高产纤溶酶相结合，有望开发成一种新型的酱香风味的功能性保健食品，区别于纳豆和豆豉，创造巨大的经济效益。目前，国内外尚未见酱香型细菌高产纤溶酶的报道。但是，与文献报道的最高产酶活性比较，该菌的产纤溶酶活性还存在一定的差距，下一步可以通过诱变及发酵培养基成分和发酵工艺参数的优化，进一步提高其产酶能力。

[1] 熊子书. 试论白酒中香味成分与风味的特征[J]. 酿酒科技, 2003(3): 82-85.

[2] 徐成勇, 郭波, 周莲, 等. 白酒香味成分研究进展[J]. 酿酒科技, 2002 (3): 38-40.

[3] 周恒刚. 酱香型白酒生产工艺的堆积[J]. 酿酒科技, 1999(1): 15-17.

[4] 谢和, 赵维娜, 秦京,等. 几株产酱香细菌的分离和鉴定[J]. 贵州农学院学报, 1992, 11(1): 80-84.

[5] SUMI H, HAMADA H, TSUSHIMA H, et al. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto, a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia, 1987, 43(10): 1110-1111.

[6] 王开敏, 赵敏. 产纤溶酶菌株的分离和鉴定及纤溶酶基因在酿酒酵母中的表达[J]. 中国食品学报, 2009, 9(2): 23-28.

[7] 刘晓艳, 刘毅. 根霉液态发酵产生纤溶酶的培养条件优化[J]. 生物技术, 2006, 16(2): 71-73.

[8] 高占争, 赵允麟. 产纤溶酶的米曲霉筛选及测定方法的研究[J]. 中国酿造, 2006, 154(1): 14-17.

[9] 宿红艳, 刘金星, 王磊, 等. 蛹虫草纤溶酶酶学性质的初步研究[J].食品科学, 2009, 30(21): 221-224.

[10] 徐德钦, 陈海燕, 章海锋, 等. 黄绿蜜环菌产纤溶酶的发酵条件优化研究[J]. 中国食品学报, 2009, 9(6): 96-103.

[11] SB/T 10317—1999 中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法[S].

[12] 范晓丹. 新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究[D].广州: 华南理工大学, 2006: 26-27.

[13] EDWARD N. Method for improving the sensitivity and specificity of the fibrin plate[J]. J Clin Path, 1972, 25: 335-337.

[14] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 353-387.

[15] 王佃亮, 刘万顺, 韩宝芹, 等. 一种新型海洋纤溶酶体外抗凝与溶栓作用研究[J]. 中国海洋药物杂志, 2006, 25(4): 37-42.

[16] 布坎南R E,吉本斯N E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 8版, 北京: 科学出版社, 1984.

[17] 邵元龙, 谢和. 两株枯草芽孢杆菌蛋白酶的提取及产酱香的研究[J].郑州轻工业学院学报, 2005, 20(3): 51-53.

[18] 周伏忠, 贾蕴莉, 陈国参, 等. 产纤溶酶菌株的分子鉴定及其液体产酶特点分析[J]. 河南科学, 2008, 26(5): 549-553.

[19] 豆孝伟, 陈桂光, 张云开, 等. 豆豉溶栓酶产生菌株的诱变育种[J].现代食品科技, 2006, 23(3): 33-38.

Screening of Maotai-flavor Strains Producing Highly Active Fibrinolytic Enzyme

LIN Fen，XIE He*
(College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

Daqu starter, vinase and pit mud applied for producing Maotai-flavor liquors were used as materials to isolate and screen strains with high activity of fibrinolytic enzyme. Totally 24 bacterial strains having excellent ability to produce Maotaiflavor and 16 ones having good ability to produce Maotai-flavor were obtained. A strain (named GZJSI-2) with the highest activity of fibrinolytic enzyme was screened out of the Maotai-flavor strains and identified as Bacillus subtilis. The activity of fibrinolytic enzyme of the fermentation broth of this strain was approximately 1479.11 U/mL and the specific activity was 21751.62 U/mg. Studies using physiological saline as a negative control and urokinase as a positive control demonstrated that the fermentation supernatant of GZJSI-2 had obvious anticoagulant and thrombolytic effects in vitro. Hence, this strain has a potential application value.

Maotai-flavor bacteria；screening；fibrinolytic enzyme；classification；identification

TS201.3；Q93.331

A

1002-6630(2010)17-0258-05

2009-12-09

林芬(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为微生物资源学。E-mail：fenlin0219@163.com

*通信作者：谢和(1963—)，男，副教授，研究方向为微生物资源学。E-mail：xieheh@163.com