紫外线辐照对马铃薯茎段愈伤组织及其再生植株的影响

陈爱芹，艾辛

（1.山西临汾市汾西县植保站，031500；2.湖南农业大学园艺园林学院）

紫外线辐照对马铃薯茎段愈伤组织及其再生植株的影响

陈爱芹1，艾辛2

（1.山西临汾市汾西县植保站，031500；2.湖南农业大学园艺园林学院）

用紫外线和低温处理马铃薯试管苗茎段，然后观察其再生过程，记载试管苗的生长速度、生长形态等及棚栽苗和扦插苗的生长特点并测定其生理指标，研究紫外线和4℃低温对大西洋马铃薯茎段组织的影响。结果表明，紫外线和4℃低温能够渗入生长点细胞；显著降低愈伤组织的生长势，诱导再生植株及其组织器官发生变异；证实紫外线照射4 min以上或紫外线照射3 min+4℃处理1个月对马铃薯具有明显的诱变效应。

大西洋马铃薯；茎段；紫外线；物理诱变

马铃薯（Solanum tuberosumL.）属茄科茄属双子叶一年生草本块茎植物，是重要的粮菜兼用作物和工业原料。在南方早春，时常会发生倒春寒天气，而此时冬闲田种植的马铃薯正进入地上部快速生长期，倒春寒会使幼苗受到不同程度的冻害，影响马铃薯的生长，从而降低后期马铃薯的产量和品质。在我国北方倒春寒同样使正值出苗期的马铃薯遭受严重冻害，为此亟待培育一些抗寒性强的马铃薯品种。本研究通过紫外线或紫外线+低温处理马铃薯的茎段愈伤组织，探讨其对马铃薯诱变的效果，以期为今后马铃薯育种提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为由湖南农业大学马铃薯课题组提供的马铃薯品种大西洋的脱毒试管苗。试验于2006年10月至2008年4月分别在湖南农业大学细胞工程实验室和园艺园林学院实验室完成。

试管苗扩繁：将试管苗切成约1 cm长、带有1～2个腋芽的茎段，在广口瓶内培养扩繁，继代3次，待试管苗扩繁至约600株，苗长至6～8片叶时切取茎段用于诱变处理。试管苗扩繁条件：培养基为MS+3%食用白糖+0.7%琼脂，pH值5.8，培养温度25℃，光照14 h/d，光强2 000 lx，继代时间2～3周。

茎段愈伤组织诱导：取试管苗茎基部不带芽的茎段，在MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.8 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%培养基上诱导，pH值5.8。

1.2 试验处理

①紫外线辐照 在超净工作台上，将新鲜、嫩绿的愈伤组织切成0.5 cm×0.5 cm的小块，放在无菌培养皿中，使之形成一薄层，在超净工作台的紫外灯（220 V，25 W）下垂直距离43 cm处进行照射试验。 试验设 7个处理， 即分别用紫外线辐照0，2，3，4，5，6，7 min（注：在进行辐照处理前，紫外灯须提前30 min打开，以确保光谱稳定），然后立即将其移入培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.25 mg/L+ 2，4-D 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 3%+琼脂0.7%上进行暗培养，大约14 d后再转入分化培养基MS+6-BA 5.0 mg/L+GA310 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%上进行培养。

②紫外线辐照+4℃低温处理 紫外线辐照及暗培养方法同①，经过暗培养14 d后，将其再次转入新鲜的增殖培养基上，然后放入4℃的低温培养箱中，保存一个月，之后再转入分化培养基MS+6-BA 5.0 mg/L+GA310 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%上进行培养。

③再生苗扩繁移栽 紫外线辐照或紫外线辐照+4℃低温处理后的再生试管苗，在MS+蔗糖3%+琼脂0.7%培养基上扩繁3代，经炼苗后于2007年11月23日移栽于湖南农业大学蔬菜基地大棚，后又转移到湖南农业大学智能温室。生长期间对其进行日常管理，如定时浇水、施肥、除杂草等。

④试管苗扦插 分别选取对照及不同处理生长3～4片叶的植株，于500 mg/L的生根剂溶液中浸泡30 min，然后扦插在土盆里，其基质的配比为：珍珠岩∶沙子∶菌渣∶泥土=2∶1∶2∶0.5，每个盆种植3株，盆栽材料移置于湖南农业大学人工气候室，室内温度设为18～25℃，湿度80%，光照时间14 h/d，光强为地面上是1.3万lx，灯下1 m是2.7万lx。待植株成活后，施加少量复合肥。

1.3 调查项目与方法

试管苗观察：观察记载不同时期试管苗生长速度、株型、叶色等的变化特征。

棚栽苗及扦插苗的观察：观察植株有无匍匐茎、花蕾、腋芽等。

叶片脯氨酸、可溶性糖含量的测定：脯氨酸含量的测定采用酸性茚三酮法；可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法。

2 结果与分析

2.1 紫外线照射时间对茎段愈伤组织存活量及存活率的影响

愈伤组织经过紫外线处理后，生长受到明显的抑制，表1列出了不同处理时间对愈伤组织存活率和生长势的影响。

由表1可以看出，茎段愈伤组织对紫外线照射比较敏感，总体表现出随着照射时间的增加，愈伤组织受损程度加重，褐变程度加大，存活率降低。当紫外线照射2 min时，愈伤组织的外观出现微小的变化，颜色与对照相比变淡，为淡绿色，2周后观察到有部分材料死亡。当处理时间大于2 min时，处理时间越长，愈伤组织的反应越明显，表现为存活量明显降低，颜色由淡绿色转为褐绿色，甚至褐色，存活率大大下降。

当处理时间为3 min时，茎段愈伤组织存活率和存活量大幅下降，其中存活率下降了30%；处理时间为4 min以上时，茎段愈伤组织存活率不超过50%，因此，3～4 min可能是紫外线加低温诱导大西洋马铃薯茎段愈伤组织变异的最适宜时间。

2.2 紫外线照射和紫外线+低温处理对茎段愈伤组织分化率的影响

愈伤组织的分化能力是衡量愈伤活力的重要参考依据，愈伤材料经过紫外线和紫外线+低温处理后，接种于最优的分化培养基上进行分化培养，以没有经过处理的愈伤组织作为对照，发现愈伤组织的分化能力也受到了影响，表2、表3分别为紫外线和紫外线+低温处理对愈伤组织进行不同时间处理后的分化率。

①由表2的统计结果表明，随着紫外线处理时间的增加，愈伤组织的分化能力呈下降趋势，当照射时间为4 min，愈伤组织的分化率为48.9%，3周后观察，没有经过处理的大西洋马铃薯愈伤组织开始分化，5周后观察，2 min处理的愈伤组织开始分化，6周后观察，3，4 min处理的愈伤组织有不定芽形成，随着紫外线处理时间的增加，不定芽的形成时间也随之延长，分化率也随之降低。

②由表3的统计结果表明，经过紫外线和1个月4℃的低温共同作用，大西洋马铃薯愈伤组织的分化能力比单独经过紫外线处理的分化能力明显降低。由此表明，4℃的低温处理对大西洋马铃薯愈伤组织的分化能力有一定的抑制作用。对照的愈伤组织分化能力由原来的98.5%降至为86.4%，开始分化时间由原来的3周延迟到5周。当照射时间为3 min，愈伤组织的分化率由原来的53.7%降至为47.8%，不定芽的形成时间由原来的第6周推迟到第9周。当照射时间为4 min，愈伤组织的分化率由原来的48.9%降至为43.2%，愈伤组织不定芽的形成时间也随之延迟。随着低温和紫外线处理时间的增加，分化率也随之降低，不定芽的形成时间也随之延长。

表1 茎段愈伤组织对紫外线照射不同时间的反应

总之，根据辐照和辐照+低温处理后愈伤组织的分化能力，认为以诱变为目的的紫外线辐照的适宜时间为3～4 min。

表2 紫外线不同处理时间对愈伤组织分化率的影响

表3 紫外线+4℃温度处理对愈伤组织分化率的影响

2.3 紫外线诱变再生植株的鉴定

①再生植株后代的形态变异 处理后的再生植株早期表现生长减慢或停止，节间变短，株高普遍小于正常植株。继代数次后逐渐观察到茎色变绿、不定根生长异常等变异现象。进入盆栽和扦插苗阶段仍发现新的性状变异，如腋叶变异、匍匐茎变异、花期变异等。

腋叶变异，指腋叶出现的早晚和多少。处理2的植株腋叶出现的比对照植株早和多。由此可以看出，在生长条件相同的情况下，紫外线处理打破了植株苗期顶端优势，有利于植株腋芽的形成，而低温处理更可促进植株健壮生长，为后期马铃薯块茎的形成奠定了基础（图1，2，3）。

图1 对照组的扦插苗

图2 紫外线处理的扦插苗

图3 紫外线+低温处理的扦插苗

匍匐茎变异，指在生长期间匍匐茎有无和多少。没有经过处理的试管苗在苗期匍匐茎大量出现，发生概率为88.6%，处理1匍匐茎发生概率为43.2%，处理 2匍匐茎出现少，发生概率仅为12.4%。由此可以看出，愈伤阶段的处理不利于试管苗在苗期形成匍匐茎。

开花期变异，指在幼苗生长期间花蕾形成的早晚和有无。在2008年3月9日发现处理2中编号为A14，A71的植株有花蕾形成；3月13日发现处理1编号为B1的植株有花蕾形成；3月19日处理1编号为B2，B4，B11的植株有花蕾形成，处理2有8棵植株有花蕾形成，其编号为A23，A24，A11，A49，A68，A64，A61，而在此期间对照未发现出现花蕾的植株。综合计算，处理2有花蕾形成的植株占总数的7.1%，处理1有花蕾形成的植株占总数的4.0%。通过测定各处理植株叶片中游离脯氨酸和可溶性糖含量发现，花蕾形成早的植株其体内的游离脯氨酸和可溶性糖的含量都比较高，表明愈伤阶段的处理不仅有利于植株开花期提前，大大缩短植株的生育期，而且还可以提高大西洋马铃薯植物组织内的脯氨酸和可溶性糖的含量，为大西洋马铃薯早熟品种的选育提供有利的帮助。

表4 群体植株叶片内游离脯氨酸测量结果

表5 群体植株叶片内可溶性糖测试结果

②叶片内游离脯氨酸含量的测定 将半致死剂量分化得到的再生植株炼苗后进行移栽，生长一段时间后，取一定数量的对照、处理1和处理2的植株，选取处于同一生长期的叶片，测定其游离脯氨酸含量。结果发现，处理1和处理2均有部分植株脯氨酸含量大于或小于对照，其中处理1有3株的叶片低于对照，变异率为3%（总株数为100）；脯氨酸含量高于对照的有9株，变异率为9%，88%的植株脯氨酸含量与对照相差不大。而处理2总的变异率为17%（其中低于对照的为1.4%，高于对照的为15.6%，总株数为140）。

测定其叶片内游离脯氨酸含量，计算平均值，结果见表4。经紫外线处理的再生植株叶片游离脯氨酸的平均含量是对照组的1.05倍；经紫外线和低温共同处理的再生植株叶片内的游离脯氨酸平均含量是对照组的1.25倍，但2个处理间游离脯氨酸平均含量相差不大，因此认为紫外线或紫外线和低温的共同诱变处理均能有效提高叶片内游离脯氨酸的含量。

表6 紫外线诱变后再生植株叶片内脯氨酸和糖的方差分析

表7 紫外线＋低温处理后再生植株叶片内脯氨酸和糖的方差分析

③叶片内可溶性糖含量的测定 通过调查不同单株间的可溶性糖含量差异发现，与对照相比，处理1中可溶性糖含量低于对照的有3株（总株数100），变异率为3%，高于对照的有15株，变异率为15%；而处理2可溶性糖含量低于对照的有3株（总株数140），变异率为2.1%，高于对照的有24株，变异率为17.2%。

分析经处理后的再生植株和未经处理的再生植株体内可溶性糖的含量，得平均值，结果见表5，处理后的再生植株体内可溶性糖的平均含量都比对照高，且处理2的叶片可溶性糖含量高于处理1，这说明紫外线或紫外线和低温的共同作用都可以提高组织内的可溶性糖的含量。

④变异株体内游离脯氨酸和可溶性糖的关系由表6可以看出，各F值间的关系是脯氨酸大于可溶性糖，说明茎段愈伤组织经过紫外线诱变后，再生植株叶片内脯氨酸含量为主效因子，糖含量为次效因子。由此可以得出，经过紫外线诱变处理后，植物体内脯氨酸的含量可以作为一个首先考虑的生理生化测定指标。

由表7可以看出，各F值间的关系是脯氨酸大于可溶性糖，说明茎段愈伤组织经过紫外线诱变后，在经过4℃低温保存一个月，再生植株叶片内脯氨酸的含量为主效因子，糖的含量为次效因子。由此可以得出，经过紫外线和低温共同处理后，植物体内脯氨酸的含量可以作为一个首先考虑的生理生化测定指标。

3 小结与讨论

紫外线作为一种诱变剂，具有操作方便、安全、无污染、无化学残留、诱变力强等特点。目前研究大多集中在UV-B辐照对植物形态学和生理学方面的影响，而对UV-C辐射对植物方面研究的较少[1]。在诱导愈伤组织诱变上，秦改花[2]对红地球葡萄的茎段离体培养及愈伤组织的紫外线照射试验的研究结果表明，叶片愈伤组织小颗粒的紫外线照射适宜时间是1～2 min，茎段愈伤组织的紫外线照射的适宜时间是3～4 min，但未见到芽的分化。李波等[3]对紫外线诱变苜蓿愈伤组织抗旱性的研究结果表明，诱变处理的POD、可溶性蛋白、脯氨酸含量均比未处理的高。本试验以大西洋马铃薯茎段愈伤组织为试验材料，进行诱变研究。初步结论是：①紫外线或紫外线和4℃低温能够有效渗入生长点细胞。②诱变剂的处理使试管苗生长量显著小于对照。③大西洋马铃薯在紫外线照射4 min或紫外线照射3 min和4℃低温保存一个月后引起了可以肉眼看到和分析的变异，包括匍匐茎变异、花期变异、腋叶变异，叶片中脯氨酸、可溶性糖含量的变异，而且这些变异在同一棵植株上表现具有相关性。

本试验初步证实，紫外线辐照或紫外线辐照和4℃低温作用结合茎段组织培养是一条可以使大西洋马铃薯产生变异的诱变途径。但这种变异是否能够在后代中保持，仍需要进一步的研究。

[1]郑有飞，颜景义，万长健.紫外辐射增加对农作物的影响及其对策[J].中国农业气象，1996，16（2）：15-19.

[2]秦改花.红地球葡萄的茎段离体培养及愈伤组织的紫外线照射试验[D].雅安：四川农业大学，2004.

[3]李波，贾秀峰，焦德志，等.紫外线诱变苜蓿愈伤组织抗旱性的研究[J].干旱地区农业研究，2005，26（6）：103-105.

Effects of Ultraviolet Radication on Potato Stem Callus and its Regeneration Plant

CHEN Aiqin1,AI Xin2
(1.Plant Protection Station of Linfen County,Shanxi 031500;2.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University,Changsha 410128)

The stem segments of Atlantic potato treated with UV-C,and treatment effects of UV-C on tetraploid potato Atlantic were studied through investigation of plant regeneration process and morphology of the regenerated plantlets in vitro,plastic tunnel observation and physiological index of the plants grown in Artificial climate room.The UV-C and four temperature could penetrate into the cells of growing point.Growth increment of plantlets in vitro derived from the stem segments treated with UV-C or UV-C and four temperature was significantly lower than that of controls,and variations of the regenerated plants and their organs were observed.The experimental data indicated that UV-C or UV-C and four temperature treatment of stem segments in UV-C for 4 min or UV-C for 3 min and four temperature could produce obvious mutations,as the foundation work,has provided reference for further research in this field.

Atlantic potato;Stem segment;Ultraviolet;Physical mutagenesis

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.22.004

陈爱芹（1981-），女，植保站干事，主要从事蔬菜抗性研究，电话：15935774033，E-mail：chenaiqin0101@163.com.cn

艾辛（1963-），男，通信作者，教授，主要从事蔬菜生物学技术研究，电话：15874245032，E-mail：caqgh2005@yahoo.com.cn

2010-06-11