糖尿病肾病大鼠炎性细胞因子的变化

郄会卿 董焕娥 吴亚 王春秀 刘东梅

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见而严重的慢性微血管病变的并发症，是引起终末期肾病的最常见病因之一。在 DN的发生发展过程中，糖或脂代谢紊乱、氧化失衡、血管活性物质、遗传因素以及细胞因子等均起着重要作用。目前，炎性反应在DN发病中的作用越来越受到人们的关注。本实验旨在观察DN大鼠血液细胞因子白介素(IL)-6、IL-8、IL-10、C-反应蛋白(CRP)变化并从炎症方面探讨其可能的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 体重 100～120 g清洁级、健康雄性 Wistar大鼠 24只，河北省实验动物中心提供。

1.2 试剂与仪器 IL-6、IL-8、IL-10购自美国 Sigma公司；CRP、血糖、尿素氮、肌肝均购自上海科华生物工程股份有限公司；芬兰产 Multisken Ascent型全自动酶标仪；日本产日立 7170-A全自动生化分析仪。

1.3 动物模型及试验方法 按Anderson等[1]建立的方法，将24只雄性Wistar大鼠用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后行右肾切除术。2周后将大鼠随机分为 2组，即右肾切除对照组(C组，n=12)、DN模型组(DN组，n=24)。C组只注射等量的枸橼酸缓冲液。DN模型采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(65mg/kg，溶于 p H值 4.5枸橼酸缓冲液中)诱导，于给药后 48h测血糖，凡全血血糖≥16.7mmol/L，尿糖 +++～++++者确定为 DN模型，实验期间动物自由进食饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。DN模型建成后，每周测血糖 1次，不符合标准者弃去。分别于第 8、12周末每组取 6只大鼠处死，处死后迅速取出左肾称重。处死前分别用代谢笼收集 24 h尿，测尿蛋白；股动脉取血，分离血清，检测 IL-6、IL-8、IL-10、CRP、血糖、尿素氮、血肌酐。

1.4 观察指标 采血完毕，立即打开腹腔游离肾脏称重。CRP采用免疫比浊法，血糖用葡萄糖氧化酶法，肌肝用碱性苦味酸法，尿素 氮用紫外-谷氨 酸脱氢酶法。 IL-6、IL-8、IL-10采用ELASA酶免法。

1.5 统计学分析 应用SAS 9.2统计软件，计量资料以¯x±s表示，显著性检验采用两两比较的Q检验分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

DN组 8、12周大鼠肾重/体重比值、血糖、尿素氮、肌肝、24 h尿蛋白、CRP、IL-6、IL-8、IL-10与 C组相应时间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。 IL-10与 CRP、IL-6、IL-8呈负相关(r值分别为 -0.5491、-0.6285、 -0.6984，P＜0.05)。见表 1。

表 1 2组观察指标比较n=6，¯x±s

3 讨论

DN的发生发展是多因素综合作用的结果。其病理特点为肾小球基底膜增厚、肾小球系膜区细胞外基质沉积，最终肾小球硬化伴或不伴肾小管间质纤维化。有关炎性因子及促炎性因子与 DN的发生发展密切相关，并认为DN是一种炎症性疾病[2]。IL-6、IL-8、CRP是重要的致炎性细胞因子，而 IL-10是抑制多种致炎性细胞因子分泌的抗炎性细胞因子之一。本研究结果显示 DN大鼠血中炎性因子 IL-6、IL-8、CRP显著高于对照组(P＜0.05)，而抗炎性细胞因子 IL-10显著低于 C组(P＜0.05)，提示 DN疾病的发病过程存在急性时相反应，IL-6、IL-8、IL-10、CRP在糖尿病肾病的发生发展中起重要作用，DN的发生发展过程中炎性细胞因子分泌活跃，而抗炎细胞因子分泌相对减弱。炎性反应可通过多种途径导致肾脏损伤。高糖可致肾小球系膜细胞产生IL-6[3]，IL-6又可直接刺激肾小球系膜细胞增殖，细胞外基质的合成，使肾小球滤过膜增厚，导致肾小球硬化，肾小管功能损害，并作用于血管内皮细胞，诱导其表达黏附分子和促凝血因子，黏附炎症细胞，促进血管内血栓形成，增加毛细血管通透性，从而促进 DN的发生发展。IL-8有较强的趋化和激活嗜中性粒细胞、淋巴细胞的作用，在炎性反应中起重要作用，研究发现 2型糖尿病肾病患者尿液中IL-8水平升高并与血液中糖基化血红蛋白水平呈正相关[4]，提示 IL-8参与诱发和维持DN的炎性反应，并可能影响肾脏功能。IL-8通过影响肾小球基底膜上硫酸化合物的代谢使肾小球基底膜通透性增高[5]，在肾小球炎症及肾小球硬化过程中其重要作用。CRP是主要由肝细胞合成的炎症相关急性时相反应蛋白，IL-6等细胞因子也可刺激肝细胞生成 CRP。国外研究报道在糖尿病所有微血管并发症中只有 DN和血清中CRP水平有关，说明炎性反应在 DN的发生发展中发挥着重要作用[6]。CRP可直接作用于肾小球小动脉，使血管内皮细胞功能障碍，白细胞或血小板对内皮细胞的黏附性和通透性增加，加重肾小球高滤过高灌注状态，引起肾脏损伤导致DN的形成。

IL-10又名细胞因子合成抑制因子，是重要的抗炎因子之一，主要由单核-巨噬细胞、T细胞、B细胞产生。作为一个重要的免疫调节因子，一方面抑制炎性细胞如单核细胞、淋巴细胞等的黏附浸润，另一方面可抑制单核细胞、巨噬细胞抗原递成功能，抑制合成、释放前炎性细胞因子，通过多种途径发挥抗炎作用。IL-10能抑制中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及单核细胞分泌产生 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等前炎性细胞因子，并能调节纤溶系统，抑制内毒素血症时的凝血反应；另外，炎性细胞因子也可调节 IL-10的产生。它们之间形成了复杂的细胞因子网络，相互协调，相互作用。本研究相关分析提示IL-10与致炎细胞因子与 IL-6、IL-8、CRP显著负相关(P＜0.05)，提示 DN发生发展中抗炎细胞因子与致炎细胞因子共同发挥作用。DN的发生时炎性 IL-10分泌减少，不足以对抗炎性细胞因子的作用，而体内过高的炎性因子则通过刺激肾小球系膜细胞的增生，使肾小球肥大，导致肾小球硬化，并能诱生氧自由基增多而损伤血管内膜。同时还能诱导血管内皮细胞产生血小板活化因子，抑制抗凝血功能，促进血栓的形成，最终导致肾功能受到损害。

总之，DN的发生发展与炎性细胞因子和抗炎细胞因子的失衡有关，炎性细胞因子分泌活跃，而抗炎细胞因子分泌相对减弱。抗炎细胞因子产生的量不足以对抗促炎因子的作用，最终导致 DN的发生。检测糖尿病肾病血清中的 IL-6、IL-8、IL-10、CRP水平变化，对临床的诊断、治疗及指导临床用药有重要的意义。

1 Anderson S，Rennke HG，Brenner BM.Nifedipine versus fosinopril in uninephrectomized diabetic rats.Kidney Int，1992，41:891-897.

2 Mora C，Navarro JF.The role of inflammation asa pathogenic factor in the development of renal disease in diabetes.Curr Diab Rep，2005，5:399-401.

3 Ihm CG，Park JK，Kim HJ，et al.Effects of high glucose on interleukin-6 production in human mesangial cells.J Korean Med Sci，2002，17:208-212.

4 Tashiro K，Koyanagi I，Saitoh A，et al.Urinary levels of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)and interleukin-8(IL-8)，and renal injuries in patients with type 2 diabetic nephropathy.J Clin Lab Anal，2002，16:1-4.

5 孙万森，王娟，王竹，等.祛风通络方对系膜增生性肾小球肾炎大鼠蛋白尿及血清 IL-6与 IL-8的影响.中国中西医结合肾病杂志，2009，10:584-586.

6 Kang ES，Kim HJ，Ahn CW，et al.Relationship of serum high sensitivity C-reactive protein to metabolic syndrome and microvascular complications in type 2 diabetes.Diabetes Res Clin Pract，2005，69:151-159.