不同条件影响冷冻血小板质量的研究

陈兴智,李聚林,韦常健

(广西壮族自治区血液中心,广西 柳州 545005)

血小板输注是临床治疗因血小板减少或血小板功能障碍所致的出血等疾病的重要手段,目前可供应临床输注的血小板制剂有多种类型,主要有浓缩血小板和单采血小板制剂。以保存方式可以分为4℃冷藏、22℃常温保存、血小板冰冻干燥保存和深低温冰冻保存等。4℃冷藏血小板对细胞功能活性损伤很大,基本已经不被使用,22℃常温保存比较普遍,但是保存时间比较短,一般只有 5-7 d,低温冰冻干燥保存技术使用受众多因素影响,一时难以推广,而深低温保存冰冻血小板技术设备要求不高,也容易推广使用,目前许多血液中心或中心血站都开展这个项目,然而冷冻血小板制备与保存过程的质量问题是直接影响临床使用效果的主要原因。笔者对影响深低温保存冰冻血小板制备质量的多种因素进行研究,现报道如下:

1 材料与方法

1.1 设备 -80℃超低温冰箱,型号:MDF-382E,日本 SANYO生产;-135℃超低温冰柜,型号:MDF-2136,日本 SANYO生产;42℃电热恒温水浴箱,型号:BHW-2,北京医疗设备厂生产;数字显示测温仪,规格型号:FLuKE 50S＆50DKJ,美国进口;血小板保存箱,型号:PC 100 h和型号:PC 1200i,美国进口;澄明度检测仪,型号:CM-Ⅲ,天津大学无线电厂生产。

1.2 方法

1.2.1 5%-6%二甲基亚砜(DMSO)加入到机采血小板中,血小板采集量均≥2.8×1011/袋;分别放置于调节并显示温度为 -80℃至 -120℃之间的超低温保存箱中冷冻保存。临床输注前迅速把不同保存温度的冷冻血小板取出立即于 42℃水浴箱中融化解冻复苏,时间控制在 3 min左右。然后在澄明度检测仪前观察判断冷冻血小板的稳定性。如果在澄明度检测仪前肉眼观察有絮状不可逆聚集物或纤维蛋白等则判断质量为不合格;如果无以上现象出现,血小板呈均匀云雾状则判质量为合格。

1.2.2 方式 1:血小板由 -80℃超低温冰箱冻结后由于出现质量问题转移入 -135℃超低温冰柜保存;方式 2:直接将血小板放入 -135℃超低温冰柜冻结进行冰冻保存;方式 3:将血小板由 -85℃冻结成型后降温至 -135℃再升温至 -85℃条件下解冻。冷冻血小板复苏后分别室温下放置玻璃或瓷砖冷面介质、导热慢的纱布或毛巾等不同介质上保存一定时间,观察血小板质量情况。

1.2.3 统计学分析 使用 SPSS统计学软件对数据进行卡方检验。

2 结 果

2.1 实验中发现不是所有温度到达 -135℃保存的血小板都会发生烂袋等质量问题。经过对方式1、方式 2、方式 3三种不同冷冻、解冻方式进行考察分析,发现保存成型的温度和解冻温差是絮状不可逆聚集或纤维蛋白析出及烂袋等的主要原因。见表1。

表1 冻结与解冻温差对血小板解冻后质量的影响情况[例(%)]

2.2 -90℃条件保存的冷冻血小板共 1 483袋,其中 4袋融化解冻后放置于玻璃、瓷砖、不锈钢平面上,5 min左右出现絮状或纤维蛋白析出等。而解冻融化后放置于木板介质上或放置保存箱内震荡的 1 479袋均无絮状或纤维蛋白析出,与放置瓷砖或玻璃比较差异有统计学意义,见表 2。

表2 冷冻血小板融化后放置不同介质上纤维蛋白及絮状不可逆聚集物析出情况统计分析

2.3 2003年至 2008年我中心制备冷冻血小板在加药前均未经过震荡,冷冻保存于 -85℃至 -120℃超低温冰箱中的1 101袋冷冻血小板均已经融化复苏并应用于临床,未发现复苏后絮状不可逆聚集物和纤维蛋白析出。见表 3。

表3 加药前未震荡保存于 -85至 -120℃条件下的冷冻血小板融化复苏后放置于(22±2)℃保存质量分析

3 讨 论

血小板在参与机体凝血过程中发挥了重要的止血功能,尤其是肝脏移植手术中严重出血患者及时补充血小板及凝血因子可消除其凝血障碍[1]。随着临床医生的输血理念的改变,临床输血技术的不断提高,血小板输注在临床血液输注中占有很大的比率。然而,血小板保存在 4℃条件下活性很快下降。22℃持续振荡保存对血小板活力维持的可靠性和稳定性已经被公众认可。但是 22℃保存的血小板保存时间短,不能长期保存,采供血机构在“无偿献血”血液资源宝贵的情况下,也不能大量采集以免造成浪费,势必影响临床紧急情况的需求。在深低温条件,血小板细胞膜内外的水分都处于凝固状态,细胞生命代谢基本停止,血小板及凝血因子等功能活性物质可长期保存而不会衰退或功能耗竭,在降复温过程中添加冰冻保护剂保护下可以降低血小板低温保存经历降复温过程的损害,从而达到低温保存的目的[2]。冷冻血小板制备过程中或多或少出现絮状物的情况,并且随着保存时间的延长而出现概率逐渐增加[3]。

众多资料表明,DMSO作为冷冻保护剂,不控制降温速度情况,-80℃冰箱冷冻保存血小板在临床应用中具有显著的效果。同样也有报道 -80℃冷冻保存血小板融化复苏后有絮状不可逆聚集物或纤维蛋白析出等不稳定现象的发生[4]。笔者研究发现,方式 1:血小板由 -80℃超低温冰箱冻结后由于出现质量问题转移入 -135℃超低温冰柜保存血小板 150人份,结果出现不稳定因素的有 36人份;方式 2:直接将血小板放入 -135℃超低温冰柜冻结进行冰冻保存 7份均烂袋。方式 3:将血小板由 -85℃冻结成型后降温至 -135℃再升温至 -85℃条件下解冻 132人份均无烂袋或絮状聚集物或纤维蛋白析出,与前两者比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。调节冰箱温度为 -80℃时,在 0℃以下冷冻保存血小板内部实际降温速度较慢,特别是关键的 0℃和 -30至 -40℃之间的下降速度;而冰箱调节温度在 -85℃以下,冷冻保存血小板内部实际降温速度可以达到1℃-3℃/min[5]。正是这种原因导致方式 1影响血小板的保存质量,同时表明,一旦保存过程导致质量的问题是无法复原的。

在处理医院退回有絮状聚集物血小板的调查中发现,医院取回冷冻血小板进行出入库登记过程,将血小板暂存于玻璃或瓷砖等导热性能较好的介质上,导致了冷冻血小板出现絮状聚集物析出。而我们进行出入库过程将血小板放置室温纱布、毛巾介质或(22±2)℃暂存,均未发生类似质量问题。笔者总结发现冷冻血小板融化后输血前放置的介质对血小板质量有影响,即导热性能好的玻璃或瓷砖上放置融化后的血小板 100%出现絮状聚集物,而室温条件下短时间放置垫有纱布、毛巾介质或(22±2)℃保存,絮状聚集物为 0%,两者比较差异有统计学意义(x2=547.69,P＜0.01)。

长时间实践表明,冷冻血小板具有止血效果好、作用快等特点,经临床应用观察证明其安全可靠[6],其冷冻保护剂 DMSO在其他血液成分保存中也有应用[7]。血小板放置 -85℃至 -120℃之间保存,临床使用前融化复苏,放置于室温内的纱布、毛巾介质上或(22±2)℃保存箱暂短存放可保持良好的稳定性。影响冷冻保存血小板质量的因素众多,综合考虑各方面因素可以避免冷冻血小板融化复苏过程或复苏后絮状聚集物或纤维蛋白析出,从而确保冷冻血小板的质量,保证临床输注血小板的有效性,相信在应急储备及临床急救方面一定能发挥重要的作用。

[1] 曾永芳,郭 鹏,陈方祥,等.血小板、冷沉淀在肝脏移植术中的联合应用[J].重庆医学,2009,38(12)∶1 431-1 432.

[2] 刘景汉,车 辑.血小板保存[J].中国输血杂志,2008,21(4)∶241-242.

[3] 薄玉芳,丁国良.冰冻前存放时间对冰冻血小板质量的影响[J].临床输血与检验,2008,10(1)∶75.

[4] 孙艳萍,袁 媛,陈召江,等.冰冻血小板融化复苏后不可逆聚集的原因分析[J].临床输血与检验,2005,7(2)∶88-89.

[5] 陈兴智,李聚林,张 源,等.冷冻血小板稳定性的研究[J].临床输血与检验,2008,10(1)∶48-51.

[6] 李聚林,罗 志,何伟兰,等.冷冻血小板临床应用的比较研究[J].广西医学,2005,27(10)∶1 534-1 536.

[7] 庄 远,刘景汉,欧阳锡林,等.二甲基亚砜在人红细胞冻干前负载海藻糖过程中的作用[J].中国输血杂志,2007,20(2)∶93-95.