Plk1、P53、P21WAF1/CIP1 在结直肠癌发生中相关关系的研究

陈彦杰

Polo-Like激酶1(Plk1)是参与有丝分裂调控的重要因子，与细胞增殖密切相关。人体许多恶性肿瘤中Plk1都存在过度表达，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。野生型P53是最常发生突变的抑癌基因，而Plk1被认为是肿瘤抑制因子P53的负向调节器，Plk1分子的过剩以及P53分子的短缺将导致肿瘤形成。细胞增殖抑制基因P21WAF1/CIP1(P21)是P53基因蛋白的下游调控因子，P53基因突变会诱导P21蛋白产生减少，使细胞周期调节紊乱，而导致细胞增殖失控，引起肿瘤发生。近年来一系列的体外细胞分子实验研究表明三者在细胞增殖发生癌变过程中密切相关，但在体内肿瘤蛋白质水平上的研究并不多，尤其在结直肠癌的发生中，对于Plk1与P53之间相互关系的研究国内只有1例报道，P53和P21的相关性研究结论并不一致，而三者之间的相关关系的研究笔者尚未见国内外报道。本研究采用免疫组化方法检测三者在结直肠癌中的表达，在蛋白质水平探讨它们在结直肠癌发生中的相关关系。由于组织中野生型P53的表达水平很低，半衰期很短，常规免疫组化方法无法测出。野生型P53发生突变后，原有功能消失，新产生的突变型P53半衰期明显延长，通过常规免疫组化方法即可以测出。因此如果在肿瘤组织中通过免疫组化方法测出P53的表达，是突变型P53，P53蛋白阳性表达表示细胞中的P53蛋白具有促癌作用或失去抑癌作用。

1 材料与方法

1．1 标本来源 收集我院2008年3月至2010年5月结直肠腺癌标本60例，其中男28例，女32例;年龄19～78岁，平均年龄58岁;发生部位:结肠癌25例，直肠癌35例;组织分化程度高分化腺癌24例，中分化腺癌20例，低分化腺癌16例。所有患者均为散发病例，且为初次手术，术前未作任何抗肿瘤治疗。另选20例正常结直肠黏膜作为对照。

1．2 方法 采用MaxVision TM即用型快速免疫组化一步法。鼠抗人Plk1单克隆抗体原液、抗体稀释液购自美国Santa Cruz公司，稀释度为1∶80;即用型鼠抗人 P53、P21WAF1/CIP1和MaxVisionTM即用型试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。所有标本均用13%甲醛固定，石蜡包埋，3μm连续切片，玻片经APES防脱处理，常规脱蜡和水化。染色前经高温高压抗原修复法预处理，抗原修复液和洗液均采用pH值7．4 PBS缓冲液。一抗室温孵育1．5 h，二抗室温孵育20 min，DAB显色，苏木素复染。用已知阳性结肠癌标本做阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1．3 判定标准 Plk1蛋白表达主要定位与细胞浆，间质有弱表达;P53和P21蛋白阳性则定位于细胞核。每张切片选5个具有代表性的高倍视野，每个视野计数100个细胞，观察免疫组织化学的染色情况。采用IHS评分，评分方法如下:(1)阳性细胞染色强弱(记为a):未着色为0分，淡黄色1分，黄色为2分，棕黄色为3分。(2)阳性细胞百分比(记为b):＜5%为0分，6% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～80%为3分，81% ～100%为4分。(3)a与b乘积为IHS评分进行半定量分析:0～1为阴性－，2～4分为弱阳性+，5～8分为中度阳性++，9～12分为强阳性+++。阳性定义2～12分，阴性定义0～1分。

1．4 统计学分析 应用SPSS 18．0统计软件，计数资料采用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 Plk1、P53、P21WAF1/CIP1蛋白的表达情况 Plk1在20例正常黏膜中，阳性表达3例，阳性率15%，且为弱表达(+);在60例腺癌中，阳性表达47例，阳性率78．3%，着色程度弱阳性5例，中度阳性20例，强阳性35例。P53在20例正常黏膜中阳性1例，阳性率5%;60例腺癌中阳性表达44例，阳性率73．3%，着色程度弱阳性8例，中度阳性17例，强阳性19例。P21在20例正常黏膜中，阳性表达18例，阳性率90%，弱阳性4例，中度阳性5例，强阳性10例;在60例腺癌中阳性表达19例，阳性率31．7%，弱阳性7例，中度阳性8例，强阳性4例。见图1～9。3组与对照组表达差异均有统计学意义(P＜0．01)。

2．2 Plk1、P53、P21与临床病例特征的关系 本研究组三种蛋白与病例的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、Dukes’分期均未发现有相关性(P ＞0．05)。

2．3 Plk1、P53、P21蛋白表达的相关关系 结直肠腺癌中Plk1与P53二者呈正相关关系(r=0．567，P ＜0．05);P53与P21呈负相关关系(r= －0．643，P ＜0．05);Plk1与 P21比较，呈负(r= －0．599，P ＜0．05);Plk1、P53联合表达与 P21 呈负相关关系(r= －0．656，P ＜0．05)。见表 1。

表1 Plk1、P53、P21蛋白在结直肠癌中表达的相关关系分析 例

2．4 Plk1、P53联合表达与P21呈负相关关系在肿瘤分化程度的相关性 5例同阳病例3例出现在低分化腺癌组，占60%，1例出现在中分化腺癌组，占20%，1例出现在高分化腺癌组，占20%。低分化腺癌组与中、高分化腺癌组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。但其他表达方式未发现有分布差异。

图1 Plk1在正常黏膜中的阴性表达(SP×400)

图2 P53在正常黏膜中的阴性表达(SP×400)

图3 P21在正常黏膜中的阳性表达(SP×400)

图4 Plk1在结肠中分化腺癌中的阴性表达(SP×400)

图5 P53在结肠中分化腺癌中的阴性表达

图6 P21在结肠中分化腺癌中的阳性表达(SP×400)

图7 Plk1在直肠高分化腺癌中的阳性表达

图8 P53在直肠高分化腺癌中的阳性表达(SP×400)

图9 P21在直肠高分化腺癌中的阴性表达(SP×400)

3 讨论

细胞周期与肿瘤的关系是近年来生命科学研究中的热门课题之一，肿瘤是一类细胞周期性疾病。Plk1是Plk家族中的一员，在细胞的有丝分裂中起广泛调节作用，具有调控细胞周期、抑制细胞凋亡等作用。PLK1的主要功能表现在细胞周期G2/M交界点转换过程中通过磷酸化下游底物而实现其功能，阻断plk1表达可导致体外肿瘤细胞分裂停滞及凋亡，Plk1的过表达能促进肿瘤的恶转化在肿瘤发生发展中发挥着重要作用。P53是最常发生突变的抑癌基因，Yang等［1］关于P53致癌机制的研究发现P53是Plk1的作用靶点之一，Plk1分子通过调节Topors磷酸化机制从而抑制了P53的功能，Plk1的过表达可以导致P53的突变，抑制P53的抑癌作用，Plk1分子的过剩以及P53分子的短缺将导致肿瘤形成。对于P53-依赖的转录激活作用的靶点是细胞周期蛋白-依赖上激酶抑制因子P21WAF1/CIP1是细胞周期负调控因子，具有阻滞细胞通过G1/S期的作用，从而抑制细胞增殖，P53是通过P21发挥它的功能。所以也可猜测Plk1是P21的负向调节器［2］。在一项P53缺失的肺癌细胞H1299的研究中他们发现外源性Plk1和P53的表达可以明显降低P21的转录，荧光分析也表明Plk1能阻断P53依赖的内源性的P21的诱导作用［2］。可见三者在细胞增殖发生癌变过程中密切相关。

关于Plk1、P53、P21三者相关关系的研究，大多是体外细胞实验，在体内肿瘤蛋白质水平上的研究尤其在结直肠癌中的研究并不多见，研究结果也不统一。在本研究中Plk1与P53的过表达、Plk1与P53之间正相关关系与文献［3］结果基本一致。本研究还发现Plk1与P21呈负相关相关系，在中高分化腺癌组Plk1、P53联合表达与P21表达呈负相关关系，在低分化腺癌组同阳表达病例的高比率可能提示三者作用于低分化腺癌的发生过程中有其他作用因子参与，也可能与选取病例有关，进一步的证明尚需更多研究。本研究证明了Plk1、P53、P21在结直肠癌发生中关系密切，这一结论为三者在结直肠癌发生过程中的相关作用靶点关系提供了组织学依据，同时展望在结直肠腺癌的治疗中可以采取从Plk1、P53、P21三个治疗靶点联合治疗的方法，为更有效的分子靶向治疗癌症研究提供依据。

1 Yang X，Li H，Zhou Z，et al．Plk1-mediated phosphorylation of Topors regulates p53 stability．JBiol Chem，2009，10:18588-18592．

2 董宪喆，张鹏，毕明刚．丝/苏氨酸激酶PLK1研究进展．中国药理通报，2010，26:289-293．

3 Manguila Flavien，许文怀，王智勇．大肠癌中P53和P21WAF1/CIP1蛋白表达及其意义．北京大学学报，2001，33:582．