单用A23187诱导外周血单个核细胞成树突状细胞及其介导耐药肿瘤细胞杀伤的实验研究

王宝中 王丽萍 王彦文 张丽华 孙桂明

1 材料与方法

1.1 材料来源

MCF-7/ADM(耐阿霉素乳腺癌细胞系)由中国医学科学院血液病研究所惠赠。A23187为SIGMA公司产品；rhGM-CSF为厦门特宝公司产品；rhIL-4、rhTNF-a为STRATHMANN BIOTECH GMBH产品；RPMI1640干粉(美国GIBCOBRL)；MTT试剂、二甲基亚砜(DMSO)均购自SIGMA公司。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 钙离子载体(A23187)诱导单核细胞

1.2.2 联合细胞因子诱导单核细胞

1.2.3 收获树突状细胞的鉴定

1.2.3.1 形态学 细胞形态学分析，倒置显微镜下观察细胞并摄影。

1.2.3.2 免疫表型 用于细胞表面标志检测的单克隆抗体分别为PE结合的鼠抗人CD1a、HLA-DR、CD83、CD80单抗及CD86单抗。

1.2.3.3 DCs激活T淋巴细胞

DC诱导特异性CTL的产生:参考文献[4]T淋巴细胞与负载特异性抗原DC按1:100效靶比混合培养72小时，收集细胞即为CTL。

1.2.3.4 MTT杀伤试验

参照文献[4]并略作改动。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 诱导培养单个核细胞形态学变化的特点

培养24小时后，光镜下见CK组诱导细胞体积增大并增殖，而A23187组除上述改变外，少数细胞已可见2～3个刺状突起。48小时后两组均见明显多形性，CK组部分细胞也可见少许突起。培养3天后，具有刺状突起的细胞数量增多，且突起更为明显，培养至7天时，多数细胞呈典型的DC形态。见图1、2。

2.2 不同诱导方式诱导DC速度的比较

不同时间各组细胞因子对K562-DC的诱导率见表1。结果表明A23187组诱导率在3天，7天时均明显高于CK组(P均＜0.05)，且A23187组3天时的诱导率已明显高于CK组7天时的诱导率(P均＜0.01)。

2.3 诱生DCs介导CTL对耐药细胞的杀伤效应

诱生DC介导的CTL(DC活化CTL的比例为1:100)对靶细胞杀伤率(MCF-7/ADM)的比较见表2。从表中数值各组DC均能激活异基因淋巴细胞并介导其对MCF-7/ADM细胞杀伤，且随效靶比的增高，杀伤率也升高；且两组之间差别无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

本课题通过联用GM-CSF、IL-4和TNF-α与A23187成功的诱导外周血单个核细胞成DC，并通过对二者的比较发现钙离子载体能更快速有效地诱导出功能活性的树突状细胞。在应用180～275ng低浓度的A23187时，PBMC能在24小时左右即可有部分细胞呈现出DCs的形态，72小时诱导率达60%左右，明显高于联用细胞因子组；且培养3天后各种表面标志的表达均与细胞因子培养7天组相同。这均提示与联合细胞因子组相比，A23187能更快速有效地将PBMC细胞诱导成为DCs。为了进一步证明此种方法诱导DC的可靠性，我们又从表型及功能方面进行了研究，结果发现经A23187诱生的DCs具有较细胞因子组相似或更强的刺激异基因淋巴细胞增殖的能力，而且证实该种来源的DC介导了CTL对耐药肿瘤细胞较强的杀伤作用。

表1 不同时间各组细胞因子DC的诱导率比较()

表1 不同时间各组细胞因子DC的诱导率比较()

注:实验重复3次。

组别诱导率3d 7d A23187组 58.8±18.6 24.5±15.1 CK组 66.5±11.4 48.5±15.3

表2 不同因子诱生DC介导的CTL对靶细胞的杀伤效应()

表2 不同因子诱生DC介导的CTL对靶细胞的杀伤效应()

注:实验重复3次。

组别 效靶比10:1 20:1 40:1 80:1 A23187-DC 12.75±2.87 21.25±9.64 32.44±10.27 43.78±12.19 CK-DC 9.59±8.47 24.04±3.43 28.82±13.78 48.25±15.56

图1 A23187诱导的PBMCDC(×400倍)

图2 联合CK诱导的PBMCDC(×400倍)

[1]Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immuneogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,9:271-296.

[2]St.Louis DC,Woodcock JB,Fransozo G,et al.Evidence for distinct intracellular signling pathways in CD34(+)progenitor to dendritic cell differentiation from a human cell model[J].J Immun,1999,162:3237-3248.

[3]孟冬梅,赵春亭,吴少玲,等.急性髓细胞白血病细胞来源的树突细胞的诱导及功能研究[J].中国实验血液学杂志,2004,12:625-631.

[4]赵春亭,王宝中,孟冬梅,等.单用A23187快速诱导K562细胞分化成树突细胞的研究[J].中华血液学杂志,2005,26:408-412.