CGRP受体拮抗剂CGRP8-37对颅脑创伤后大鼠保护作用的实验研究1)

贾志亮,刘跃亭,段虎斌

创伤性脑损伤引起的脑水肿是神经外科需要解决的一大难题。目前的方法都还不能完全克服这个难题。CGRP作为脑内存在的一种强大的扩血管物质,在脑损伤后引起的脑水肿中的具体作用目前研究甚少[1]。本实验通过免疫组化和PCR技术,动态分析CGRP及其拮抗剂在创伤性脑损伤后脑水肿形成这一病理过程中的作用,为CGRP拮抗剂应用于临床提供相关依据,同时为治疗创伤后脑水肿提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物分组 雄性Wistar大鼠90只(山西医科大学动物中心提供),体重250 g～300 g,随机分为对照组(6只)、创伤组(TBI组,42只)和CGR98-37,606组(LT组,42只)。然后再按照0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h随即分为7个亚组,创伤组和CGRP8-37组每亚组6只,对照组每亚组1只。

1.2 模型制作 创伤组和CGRP8-37组大鼠所处实验环境相同,用20%的乌拉坦腹腔注射(1.2 g/kg)麻醉满意后,将大鼠固定在脑立体定位仪上。制作TBI组模型时沿正中线切开头皮并剥离骨膜,切口长2 cm,暴露右顶骨,牙科台式电钻(宁波医疗器械厂)于冠状缝后1.5 mm,中线右旁2.5mm处钻一直径为5mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完整,用Feeney法[1]按自由落体致伤原理,通过撞击装置(军事医学科学院仪器厂),将撞杆头端置骨窗处,另用击锤(20 g)沿外周导管从30 cm高处自由落下撞击撞杆,造成右顶叶脑挫伤,骨蜡封闭骨窗,缝合头皮。于伤后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h开颅取脑。CGRP8-37组大鼠造成右顶叶脑挫伤后立即脑室内给予CGRP受体拮抗剂CGRP8-37(30 nmol/kg Sigma公司),然后也于0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h开颅取脑。对照组暴露硬脑膜后不予打击,直接关颅,缝合头皮。

1.3 免疫组化和HE染色

1.3.1 组织标本制作 将各组大鼠在相应时间断头取脑,在无菌条件下,依脑组织的损伤中心为标准冠状位,切开大脑。前半部分大脑,立即浸入4℃10%中性甲醛溶液内固定24 h～48 h。后半部分大脑放入-180℃液氮罐中,以备PCR之用。将固定后的脑组织从甲醛溶液内取出,以损伤中心为标准冠状位依向大脑后缘切(4～5)mm脑切片1个,分别进行脱水、包埋,制成蜡块。

1.3.2 苏木精-伊红(HE)染色 苏木素染液染核至蓝,1%盐酸酒精分化,1%氨水返蓝,0.1%伊红染液染细胞质,然后脱水、透明、封片。采用M IAS-2000图像分析系统拍照。

1.3.3 免疫组织化学染色 采用PV-6001二步法免疫组织化学检测试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司)。用0.01 mo l/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0),高压热修复40 s;过氧化氢孵育;加兔抗大鼠CGRP多克隆抗体(Sigma公司产品)4℃过夜,使用效价为1∶5 000。次日加辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体,37℃孵育30m in;二氨基联苯胺(DAB)显色,显微镜下控制显色时间。采用M IAS-2000图像分析系统,拍照并测定目标面积、视场面积、目标平均灰度和视场平均灰度,并通过以下公式计算阳性单位[PU=｜G 0-GV｜/(1-AAR)GMAX;PU:阳性单位,G0:目标平均灰度,GV:视场平均灰度,AAR:面积密度比值,GMAX:最大灰度(255)]。

1.4 脑组织CGRPmRNA RT-PCR测定和数据分析 在无菌条件下,从液氮罐中取出脑组织,按照对照组、TBI和CGRP8-37组相应的时间点行RT-PCR分析,按Trizol试剂(Invitrogen公司进口)说明提取组织总RNA,紫外分光光度计测定RNA含量。采用Fermentas反转录试剂盒按操作说明逆转录生成cDNA,产物进行PCR。AQP 4引物:上游序列5′-GGGTTGGACCAATCA TAGGCGCT-3′,下游序列5-GCAGGAAATCTGAGGCCAGTTCTAGG-3′,扩增片段长330 bp;GAPDH引物:上游序列5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′,下游序列5′-AGATCCACAACGGA TACA-3′,扩增片段长303 bp。退火温度72℃,反应36个循环。PCR产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测,电泳结束后,将凝胶置于图像系统处理分析,获得目的基和GAPDH的吸光度值,以GAPDH的吸光度值作为内参照,计算出目的基因与GAPDH基因之间的比值,作为AQP4 mRNA表达的水平,引物合成为上海生工生物技术服务有限公司产品。

1.5 统计学处理 运用SPSS 12.0软件进行处理,所有数据以均数±标准差(±s)表示,采用双因素重复样本的方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大体观察 从打击侧冠状切面可见:对照组大鼠在0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h等7个时间点脑组织表面光滑,沟回整齐、清晰、无充血、水肿及出血灶。TBI组脑损伤后0.5 h,皮质表面、蛛网膜下腔、挫裂伤灶周围皮质及皮质下白质均有不同程度出血,略有肿胀。伤后2 h～6 h,蛛网膜下腔出血、皮质表面挫裂伤灶,周围皮质及皮质下白质出血持续加重。12 h损伤最重,肿胀最明显。72 h后,出血基本吸收,肿胀有所减轻,但水肿程度仍高于对照组。CGRP8-37组伤后0.5 h蛛网膜下腔、皮质和皮质下组织有少量出血,后逐渐加重,2 h出血最多,肿胀最明显。6 h后出血开始吸收,水肿逐渐消退,72 h时沟回较整齐、基本无充血、水肿及出血灶。

2.2 免疫组化结果 TBI组大鼠伤后0.5 h脑组织CGRP阳性单位表达开始上调,2h、6h依次增高,12h达到高峰(P＜0.05),CGRP8-37组伤后0.5 h CGRP阳性单位表达也开始上调,随着时间的延长表达持续升高,2h达高峰,然后持续回落,72 h恢复正常(P＜0.05)。CGRP8-37组在相应时间点CGRP阳性单位表达明显低于TBI组,差异有统计学意义(P＜0.05)。对照组,TBI,CGRP8-37组创伤周边区CGRP阳性单位表达不同,(F=59 124.926,P＜0.01)。对照组伤后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相互之间CGRP阳性单位表达无统计学意义(P＞0.05)。TBI,CGRP8-37组伤后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h之间CGRP阳性单位总体有统计学意义(P＜0.01)。TBI组6 h和24 h、0.5 h和48 h CGRP阳性单位表达无统计学意义(P＞0.05)。时间和分组之间有交互效应(F=3 589.696,P＜0.01)。

2.3 脑组织CGRPmRNA的表达及其变化 TBI组大鼠伤后0.5 h脑组织CGRP mRNA表达开始上调,2 h、6 h依次增高,12 h达到高峰(P＜0.05),CGRP8-37组伤后CGRP0.5 hm RNA表达也开始上调,随着时间的推移表达持续升高,2 h达高峰,然后持续回落,72 h恢复正常(P＜0.05)。CGRP8-37组在相应时间点AQP4mRNA表达明显低于TBI组(P＜0.05)。对照,TBI,CGRP8-37组创伤周边区CGRP mRNA表达不同(F=7198.397,P＜0.01)。对照组伤后0.5h、2h、6h、12 h、24 h、48 h、72 h相互之间CGRP mRNA表达无统计学意义(P＞0.05)。TBI,CGRP8-37组伤后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h之间CGRPmRNA总体有统计学意义(F=511.471,P＜0.01)。TBI组6 h和24 h、0.5h和48 h CGRPmRNA表达无统计学意义(P＞0.05)。时间和分组之间有交互效应(F=229.026,P＜0.01)。

3 讨 论

CGRP是由Amana和Rosenfold等应用DNA基因重组和分子生物学技术于1982年首先发现的生物活性多肽,由37个氨基酸残基组成,分子量是3 786.91。免疫组化显示,CGRP样免疫阳性神经细胞可见于中枢神经系统各部,特别是感觉神经元的胞体[2]。

降钙素基因相关肽(Calcitoningene-related pep tide,CGRP)是辣椒素敏感感觉神经中主要的神经递质,具有强大的血管舒张作用。CGRP具有拮抗内皮素(ET)-1的血管收缩效应。Nozaki等[3]的实验证实其剂量依赖性,且作用强于SP、血管活性肠肽(V IP)等其他血管扩张介质[4]。

CGRP作为目前已知最强的内源性扩血管物质,其强大的扩血管作用能促进水肿的形成。具体机制是CGRP与受体结合后,激活鸟苷酸环化酶,促使细胞内环磷酸鸟苷水平升高,促进前列腺素释放,进而血管通透性升高,血浆渗出,水肿形成。同时CGRP还能抑制P物质的降解,促使SP从感觉神经末梢释放,有加强SP和其他炎性介质形成水肿的作用。CGRP不仅介导神经源性炎症,还与一些炎性细胞、免疫细胞、炎症介质和细胞因子有相互作用。CGRP能诱导人单核细胞合成IL-8等致炎因子,提高其m RNA表达水平[5]。Yamaguchi等[6]在做相似的研究中也发现CGRP能促使IL-1、IL-6和TNF-α显著增加,并成时间剂量依赖性。

本实验中,TBI组损伤区周边CGRP阳性单位在损伤初期即急剧上升,随着病情的进展,CGRP表达持续上升,12 h达高峰,这与损伤后痛觉神经末梢纤维致敏,释放大量CGRP有关。随后CGRP的表达回落,24 h,48 h,72 h持续下降,推测这是由于机体自身复杂机制的调节,如痛觉的逐渐适应和减轻,机体的免疫调节,以及机体内缩血管物质所致的拮抗作用。与TBI组相比,CGRP8-37组CGRP表达总体变化规律与前者一致,即都是先升高后降低,但后者峰值提前至2 h,且在相应时间点的表达都低于前者。CGRP8-37作为CGRP的受体拮抗剂,当其进入血脑屏障后,可与CGRP的受体竞争结合,从而使得CGRP表达量大大减少,同时又具有加快病理状态的恢复作用,即具有减轻CGRP大量释放所致的水肿和炎症的作用。这与后续的动物观察结果一致,TBI组大鼠在72 h后仍有一半不能正常进食和饮水,而给予CGRP8-37的大鼠在48 h后即有三分之二基本恢复正常,72 h时除个别外都能正常活动、进食和饮水。CGRP8-37作为CGRP的一种特异的受体拮抗剂,可以有效减轻CGRP引起的水肿和炎症因子的释放,加快病理状态的恢复。这对于脑外伤所致的脑水肿甚至脑疝有很好的预防和治疗作用。随着对CGRP研究的不断深入,将会有更多新的CGRP受体拮抗剂被研发出来,服务于临床。

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