肿瘤干细胞与消化道肿瘤的研究进展

张 祎 魏素菊 韩文峰

(河北医科大学第四医院,河北 石家庄 050011)

研究者发现肿瘤干细胞(CSC)在肿瘤的发生、发展、复发及转移过程中发挥着重要作用。CSC是存在于肿瘤组织中具有干细胞样能力的肿瘤细胞亚群,一个CSC能够产生整个肿瘤组织的(处于不同分化阶段的)所有肿瘤细胞〔1〕。CSC概念的提出为研究肿瘤细胞的生物学特性提供了新思路,并为肿瘤的临床治疗提供了新靶点,目前已逐渐成为肿瘤防治研究的新的热点。

1 CSC的起源

①干细胞:目前已经公认白血病是由带有白细胞分化抗原(CD)CD96+、CD34+、CD38-标记的白血病干细胞引起的恶性肿瘤〔2〕。 ②成熟体细胞:Cocciadiferro等〔3〕通过研究干细胞标志物胚胎干细胞相关蛋白(Oct-4)、zeste基因 12抑制剂(SUZ-12)和表皮生长因子(EGF)家族成员(Cripto-1)在雄激素反应型 LNCaP和非反应型PC3细胞系中的表达认为前列腺癌CSC可能来源于已分化的成熟细胞。③CSC异常的细胞融合产生的杂交细胞。④静止的胚胎干细胞:人们发现在很多CSC中表达一些胚胎干细胞的标记基因如胚胎干细胞相关蛋白、HMG盒转录因子(Sox2)等〔4〕。⑤与病毒有关:Chaudhary博士认为病毒可促进变异细胞群进一步生长和复制,最终完全癌变〔5〕。⑥与骨髓来源的细胞有关:近期研究表明,胃癌的 CSC起源于骨髓来源的细胞〔6〕。

2 CSC生成的调节

2.1 微环境与CSC的发生 微环境可以决定干细胞的分化方向。畸胎瘤细胞注入鼠囊胚内细胞团可以形成正常胚胎。基因型正常的胚胎干细胞向同系小鼠腹腔移植可产生极度恶性的肿瘤。

2.2 细胞周期调节因子与 CSC的发生 Yuan等〔7〕在进行细胞周期调节因子 p18完全缺失的造血细胞重建试验后发现此细胞具有更强的自我更新能力,而且在干细胞水平没有向白血病细胞转化,但一小部分接受移植的鼠出现了急性T淋巴细胞白血病,但白血病的发展伴随抑癌蛋白 p15或 p16基因启动子区的甲基化及细胞周期调节因子p18基因的缺失,且从这些发生白血病的小鼠中分离的造血干细胞不会将白血病的表型转移到别的受体鼠,表明细胞周期调节因子p18下调造成干细胞自我更新加强后不足以引起白血病发生,但抑癌蛋白 p15或p 16破坏后可能促进了白血病干细胞的形成并影响正常造血过程的进行。

3 CSC的识别、分离与鉴定

CSC的识别、分离与鉴定是目前研究重点。基于对正常干细胞的认识,且因CSC表面标记(膜蛋白、黏附分子及受体等)与一般肿瘤细胞不同,可使用正常干细胞标记物,采用流式细胞仪或免疫磁珠法进行分选。正常干细胞标记物有巢蛋白、白细胞分化抗原 CD133等。Beier等〔8〕发现人脑胶质瘤组织中脑CSC的表面标志物为 CD133+。Eramo等报道,注射 104个只占肺癌组织 0.32%～1.13%的CD133+的细胞,可在重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠中形成移植瘤,实验还证实 CD133+细胞在含上皮生长因子的无血清培养基中形成瘤球,具有多向分化和自我更新能力,认为CD133可作为肺癌干细胞标志物,他们还也发现肺癌干细胞属于 CD133+细胞〔9〕。 Levina等〔10〕将 H460肺癌细胞株培养细胞通过阿霉素(ADM)、顺铂(CDDP)、依托泊苷(VP-16)化疗后得到的细胞能形成新的克隆,且表达CD133、干细胞因子受体(CD117,又叫 C-KIT)、胚胎干细胞相关蛋白等干细胞标志物,分化后祖细胞失去 CD133表达,重新表达细胞角蛋白 8/18(CK 8/18)和获得化疗药物敏感性。作者认为这些细胞就是肺癌干细胞,化疗能导致肺癌干细胞的增殖和抑制其分化,这与其大量的细胞因子网产物有关。董强刚等〔11〕研究却发现,在 A 549和 SPC-A 1肺腺癌细胞株中应用磁性细胞分选(MACS)CSC时发现 CD133-、多药耐药蛋白(MRCP+)、CD24+、表皮生长因子受体(EGFR+)、胰岛素样生长因子受体(IGF-R1+)的细胞具备 CSC特征。Jiang等〔12〕研究发现荧光活化细胞分选系统(FACS)分离出的肺癌细胞高表达醛脱氢酶 1(ALDH1)和 CD133在体外高表达 CSC特征,包括无限增殖、自我更新、分化和对化疗耐药的能力,体外实验证明醛脱氢酶 1阳性细胞可形成肿瘤,具有与原来肿瘤相似的异质性。醛脱氢酶 1成为肺癌干细胞的标志。

巢蛋白是神经祖细胞的生物学标记。Kondo等〔13〕还发现体外长期培养的肿瘤细胞系中也存在类似的CSC,称为边缘细胞群(side population,SP)。因干细胞表达乳腺癌耐药蛋白(BCRP),可排斥荧光染料罗丹明 123(Rho123)和 Hoechst33342,通过荧光染色技术结合流式细胞分选技术即荧光活化细胞分选系统分选肿瘤细胞,没有荧光的那群不被染色的细胞叫边缘细胞群。Han〔14〕研究发现具有 CSC特性的 MCF7和 T47D乳腺癌细胞系存在边缘细胞群且表达乳腺癌干细胞分子标志物,其边缘细胞群在体外形成肿瘤,且边缘细胞群比非边缘细胞群对放射线更易产生耐受,进一步证明了边缘细胞群中存在 CSC。

CSC的鉴定主要有体内移植和体外培养两个方面〔14〕。体内移植是将分离所得 CSC和一般肿瘤细胞分别移植到非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内,因 CSC仅需少量即可形成肿瘤;而一般肿瘤细胞需要大量细胞才能形成肿瘤。Bussolati〔15〕研究发现了 CSC存在于肾细胞癌中。间充质干细胞存在于正常大鼠肾脏中,实验挑选 5个肾细胞癌患者,其癌细胞中均表达间充质干细胞标志 CD105,将 CD105(+)细胞群注射到重度联合免疫缺陷小鼠体内,这些细胞群表现出致瘤性,克隆出具有 CD105(+)的细胞,观察到 CD105(+)的细胞有以下干细胞特征:①具有巢蛋白,干细胞调控因子(Nanog),胚胎干细胞相关蛋白等干细胞表面分子标志;②有克隆形成能力;③有形成瘤球黏着力;④体外生长可分化为内皮和上皮细胞;⑤体外移植可形成 CD105抗原(+)具有致瘤性的细胞群和 CD105抗原(-)的非致瘤性细胞群。

体外培养采用无血清培养基,通过集落形成实验比较两者差异。目前有学者提出,微流控芯片技术可发现更多CSC生物标记,作为识别与鉴定 CSC的方法〔16〕。最近,Cho等〔17〕将用流式细胞分选出的胸腺抗原 1(Thy1+)CD24+乳腺肿瘤细胞注射到动物模型中,发现占 1%～4%的Thy1+CD24+相比 Thy1-CD24-细胞含有更多具有致瘤性的成肿瘤细胞,且传代的肿瘤与原发肿瘤在表型和生物学特性上具有很多相似性。生物芯片技术发现两种细胞的基因表达存在差异,这为评估乳腺癌患者预后提供了新思路。但还有学者认为因对 CSC的鉴定采用了异种移植,因此对CSC学说以及其是否适用于所有类型的癌症仍存在争议。Kelly等〔18〕认为是人和小鼠细胞因子受体不相容导致了实验结果的偏差,通过小鼠肿瘤细胞移植均产生淋巴瘤的实验,认为这类细胞应被称为“肿瘤传播细胞”。Adams等〔19〕通过实验认为异种移植系统低估了能维持人类肿瘤生长的细胞比例。Yun等〔20〕还提出转基因小鼠模型可用来检测小鼠对人 CSC的宿主反应。

4 CSC与消化道肿瘤的关系

目前,消化系统肿瘤发病率较高,治愈率低,因此消化道肿瘤中是否存在 CSC引起了大家的关注。Haraguchi等〔21〕在 16种消化系统肿瘤细胞系中分离到了边缘细胞群,分布占细胞总数的 0.3%～2.2%,在肝癌细胞系 Huh7与结肠癌细胞系8W480中,边缘细胞群表现出自我更新以及分化能力,能够产生边缘细胞群和非边缘细胞群。说明消化系统的一些肿瘤中含有拥有干细胞特征的边缘细胞亚群。

4.1 CSC与口腔癌 Zhang等〔22〕分离口腔鳞状细胞癌(OCC)中边缘细胞群和非边缘细胞群并比较二者差异,边缘细胞群在裸鼠中有更强的集落形成能力,形成肿瘤需要 10 000个边缘细胞群细胞,而需要 1 000 000个非边缘细胞群细胞,边缘细胞群细胞高表达多药耐药蛋白(ABCG2)、ABCB1、CD44、胚胎干细胞相关蛋白(oct-4),致癌基因(Bmi-1),神经系统多梳蛋白(NSPc1)和细胞角蛋白19,并且边缘细胞群细胞可分化形成边缘细胞群和非边缘细胞群,而非边缘细胞群只能分化成非边缘细胞群。口腔鳞状细胞癌的边缘细胞群细胞具有 CSC表型且对口腔癌的发生起重要作用。

4.2 CSC与胃癌 Takaishi等研究通过克隆形成实验和小鼠体内成瘤实验证明胃 Ca中有 CSC,且成瘤试验与胃Ca细胞的一种表面分子标记物一致,而利用这种分子筛选的阳性细胞具有良好的克隆形态能力与体内成瘤能力,这些阳性细胞大概占肿瘤细胞的 1%～10%,Takaishi等的研究结果有力地支持了存在胃 Ca干细胞的观点〔23〕,Fukuda等也在胃 Ca细胞系中分离到一些具有肿瘤形成能力的细胞〔24〕。

4.3 CSC与结肠癌 但对CD133是否可作为结肠癌干细胞表面分子标志物的回答出现了分歧,Dalerba等〔25〕发现动物模型嗜同种的钙非依赖性上皮细胞黏附分子(EpCAM)high/CD44+的肿瘤细胞具有肿瘤干细胞特性,还高表达乙醛脱氢酶 1,且表达 CD133+的细胞群要大于 CD44+细胞群,进一步研究发现,间充质干细胞标记物 CD166抗原分子可作为结直肠癌干细胞独立的标记物;因此,他们认为 EpCAMhigh/CD44+/CD166+比CD133+能更好地作为结直肠癌干细胞的标记物。

Du等〔26〕认为 CD44比 CD133更适合作为结直肠干细胞的分子标记物。但后来 Shmelkov等〔27〕通过建立半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型(CD133lacZ/+),即半乳糖苷酶基因的表达是由内源的 CD133启动子驱动的;发现 CD133既表达于干细胞,也表达于分化的结肠上皮细胞中,但在转移结肠癌和具有致瘤性的细胞中并不都表达 CD133,且研究发现表达CD133+和CD133-的转移肿瘤细胞均具有致瘤性,而且具有转移性的CD133-的肿瘤细胞可以形成侵袭性更强的肿瘤,并表达典型成肿瘤细胞的表型标记物 CD44(CD44+CD24-),而表达CD133-的细胞中为 CD44-CD24+。因此,CD133+是否能作为鉴定结肠癌干细胞的标记还需要进一步的研究证实。

4.4 CSC与肝癌 原发性肝癌不同病理组织类型均可表达细胞角蛋白 7(CK7)、细胞角蛋白 19、甲胎蛋白、干细胞因子受体和胸腺抗原 1等多种肝干细胞标志,暗示了肝癌干细胞可能起源于肝干细胞。Chiba等〔28〕利用肝细胞癌(HCC)细胞系研究边缘细胞群在非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺陷小鼠致瘤的作用和 CSC的作用,实验结果表明边缘细胞群具有强致瘤性、更高增殖潜能和抗细胞凋亡的特性,细胞免疫化学检查显示边缘细胞群保持了大量的肝细胞和胆管细胞系的特征,进一步证实了肝癌中 CSC的存在。Yamashita〔29〕发现 235个肝癌标本可分离出嗜同种的钙非依赖性上皮细胞黏附分子(Ep CAM+)甲胎蛋白 AFP(+)和EpCAM(-)AFP(-)两种细胞,通过对基因表达和信号转导通路分析得出EpCAM(+)AFP(+)的肝癌细胞亚型具有肝癌干细胞或前体细胞的特征,EpCAM(+)肝癌细胞具有干细胞的自我更新和分化能力,可使非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺陷小鼠形成高侵袭性肝细胞癌。因此肝细胞癌的生长和侵袭是由一组嗜同种的钙非依赖性上皮细胞黏附分子(+)细胞决定的,进一步用小干扰 RNA(SiRNA)干扰Wnt/beta-catenin通路信号肽可减弱 EpCAM(+)肝癌细胞活性〔30〕。实验表明〔31〕Wnt信号通路异常激活赋予了肝干细胞的高增殖潜能和抗细胞凋亡的特性,嗜同种的钙非依赖性上皮细胞黏附分子可成为肝癌的分子治疗靶点。

4.5 CSC与胰腺癌 胰腺诊断明确时多处于进展期,对常规化疗和放疗都不敏感,5年存活率只有 3%。Heidt等〔32〕用人胰腺癌组织制成的细胞悬液中,候选干细胞标志 CD44、CD24和上皮细胞膜抗原(ESA)的表达率为 3%～8%,在传代细胞中亦保持较为恒定的比例。以 CD44、CD24和上皮细胞膜抗原为表型分选细胞分别在 6/9和 3/11只小鼠中成瘤,而未分选的细胞需相应分选细胞数量的 100倍才有肿瘤生长。因此认为,CD44、CD24和上皮细胞膜抗原是胰腺腺癌干细胞的标志〔32〕。研究表明〔32〕,仅占胰腺癌细胞 0.2%～0.8%的 CD44+CD24+ESA+细胞的致瘤能力是其他肿瘤细胞的 100倍,注射 100个细胞后约 50%的动物形成组织学上不可分辨的相同肿瘤,表现出高度自我更新和分化等干细胞的特性,同时其 SonicHedgehog基因(SHH)的表达有所升高,说明 SHH信号通路对于自我更新同样具有调节作用〔32〕。通过以上 Wnt信号通路和 SHH信号通路在肝癌和胰腺癌等不同组织的干细胞的自我更新的调节作用,使得信号通路与自我更新关系的研究更加有趣。

5 实体CSC的研究意义和未来研究方向

5.1 研究意义 干细胞表达多药耐药蛋白(MDR1)及ABC转运蛋白,对化疗不敏感,若 CSC高表达这类分子,也有可能对治疗耐受,这解释了肿瘤治疗后复发转移现象。传统肿瘤治疗都是针对所有的肿瘤细胞,且认为肿瘤细胞具有功能同质性,而实际上如果肿瘤源于 CSC,先前诸多关于肿瘤发生发展机制,细胞信号途径的等的研究成果需要重新评价,因为CSC的生物学行为与其他肿瘤细胞可能有质的差别,如果能有效选择性杀伤 CSC,挖掘出针对 CSC而不损伤正常干细胞的治疗新靶点,就会为临床彻底治愈肿瘤带来新希望。

5.2 未来的研究方向 首先是对正常组织干细胞生物学行为、细胞表面标志物的研究,为更多实体CSC的分离鉴定提供理论支持。第二,研究实体CSC与正常组织干细胞及其他异质肿瘤细胞的差异基因及信号转导途经的差异进行功能研究,可以阐明 CSC的起源以及肿瘤发生发展的基本机制,为治疗实体肿瘤提供新靶点。因 CSC的含量极少且不断分化,所以发展高效的体外培养系统、细胞扩增技术及维持干细胞未分化状态技术是今后研究的艰巨任务。

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