张家口地区健康人群 CYP1A1基因多态性

刘 芳 孙 黎 杨翠军 李 华 刘开扬

(河北北方学院实验中心,河北 张家口 075000)

CYP1A1是细胞色素 P(CYP)450家族的一名成员,是体内重要的Ⅰ相解毒酶之一,参与多种内外源性化学物质体内代谢过程〔1〕。 CYP1A1由 CYP1A1基因编码,CYP1A1表达受基因控制和环境因素诱导,并存在种族和个体差异。主要分布于肺、肾、胃肠道、皮肤、胎盘等组织中,参与内源性和外源性化合物在体内代谢过程,主要通过氧化、还原、水解等作用,改变化合物所具有的功能基团。或使其分解。CYP1A 1主要参与多环芳烃类化合物(PAH)的代谢,把其代谢为酚类物质活性很强的环氧化物,这些环氧化物在致癌、致突变中都有重要作用〔2,3〕。目前为止,已发现CYP1A1基因 MSPI和 Ile/Val多态在不同的种族、民族和地区的分布有很大差异。本试验采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的技术,探讨张家口地区健康人群 CYP1A 1基因的 Msp I和 Ile/Val多态性分布。

1 材料与方法

1.1 研究对象 随机选择 360例无血缘关系的健康张家口地区人员,均在原籍稳定居住 2代以上,年龄 18～55岁。经张家口河北北方学院第一附属医院门诊查体健康,无遗传疾病的健康人群。其中男性 186例,女性 174例。

1.2 标本收集 从上述人群中每人抽取外周静脉全血 3 ml,EDTA抗凝,-80℃保存待测。

1.3 基因组DNA的制备 DNA提取试剂盒提取DNA。

1.4 PCR反应

1.4.1 MspI基因型测定 采用等位基因特异性扩增方法PCR-RFLP技术,MspI基因型测定所需引物,其序列为上游 5′-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3′,下游 5′-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT-3′。PCR的反应条件:反应总体积 50μl,含有200μmol/L dNTP,上、下游引物各 0.4μmol/L,基因组 DNA 0.4μg,1 U TaqDNA聚合酶。在 PCR仪上扩增,扩增参数:97℃预变性 7 min,然后 95℃,50 s,66℃复性 50 s,72℃延伸1 min,30个循环后 72℃延伸 10min。其 PCR产物为 340bp的DNA片段。取 10μl PCR产物,加 10 U Msp I限制性内切酶,37℃水浴 4 h,酶切产物经 1.8%琼脂糖凝胶(含 0.5μg/ml溴化乙锭)电泳 40 min,电压 150 V,在紫外透射仪上观察结果。

1.4.2 Ile/Val多态性测定 采用等位基因特异性扩增方法PCR-RFLP技术,分析 Ile/Val多态性,引物序列:上游 5-CTGTCTCCCTCTGGTTACAGGAAGC-3′,下游 5′-TTCCACCCGTTGCAGCAGGATAGCC-3′。反应体系同上,扩增参数:95℃预变性5 min,然后 95℃,30 s,63.5℃复性 30s,72℃延伸 30 s,30个循环后 72℃延伸 7 min。其 PCR产物为 204bp的 DNA片段。取10μl PCR产物,加 10U BsrD I限制性内切酶,25℃水浴 24 h,酶切产物观察同上。

1.5 CYP1A 1多态性

1.5.1 MspI基因型 扩增产物经酶切后分为 3种基因型:没有 MspI切割位点的等位基因m1的纯合子基因型m1m1(野生型),可见 340 bp一个片段;有 MspI切割位点的等位基因m2的纯合子基因型 m2m2(突变型),可见 200及 140 bp两个片段;m1和 m2的杂合子基因型 m1m2(杂合型),可见 340,200,140bp三个片段。

1.5.2 Ile/Val多态性 扩增产物经酶切后分为 3种基因型:没有切割位点为纯合子基因型Ile/Ile(野生型),可见 204bp一个片段;有BsrD I切割位点的等位基因Val/Val的纯合子基因型 (突变型),可见 65及 139 bp两个片段;Ile/Val(杂合型),可见 204,139,65bp三个片段。

1.6 统计学方法 采用 SPSS软件分析,用 χ2检验法比较基因多态性等位基因频率的差异,检验群体基因型频率分布是否符合 Hardy-Weinberg平衡定律。

2 结 果

2.1 CYP1A 1基因Msp I多态分布 张家口地区健康人群该基因多态位点 m1及m2等位基因的频率分别为 60.9%,39.1%。m1m1,m1m2,m2m2基因型分布频率分别为 35.8%,50.2%,14.0%。经 χ2检验基因型分布符合 Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。

2.2 CYP1A 1基因Ile/Val多态性 张家口地区健康人群该多态位点 Ile及 Val等位基因的频率分别为 68.5%,31.5%。Ile/Ile,Ile/Val,Val/Val基因型分布频率分别为 44.4%,48.1%,7.5%。经 χ2检验基因型分布符合 Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。

3 讨 论

CYP1A1是细胞色素P450家族的一名成员,是外源性和内源性化合物在体内代谢的重要Ⅰ相酶之一〔4,5〕。其参与 PAH如苯并芘的代谢,将其氧化为酚类产物和环氧化物。CYP1A1基因位于人类第 15对染色体,有 7个外显子和 6个内含子。目前研究发现,亚洲人群 CYP1A1基因在其 DNA结构的 3′端非翻译区 6235位点 T→C突变形成 MspI酶切位点,即 CYP1A 1基因 MspI多态性,突变基因可影响 CYP1A1的诱导性〔6〕,研究发现 CYP1A 1的T6235C位点突变不但增加了酶的活性,而且提高了酶的诱导性。同时,CYP1A1基因MspI多态分布具有明显的地区和种族差异。Ile/Val多态性是由于第七外显子4 889 kb位置上的 A-G突变,导致酶蛋白水平表现为亮氨酸变成缬氨酸,Val-Ile多态性可被限制性内切酶BsrDⅠ识别,研究发现携带 Ile/Val,Val/Val的病人比Ile/Ile病人在某些肿瘤疾病中表现出更大的危险性。本研究发现张家口地区正常人群CYP1A 1基因呈多态性分布,为进一步研究张家口地区CYP1A 1基因多态性与肿瘤等疾病的关系奠定了基础。

1 Miyoshi Y,Takahashi Y,Egawa C,et al.Breast cancer risk associated with CYP1A1 genetic polymorphisms in Japanese women〔J〕.Breast J,2002;8(4):20.

2 Hayashi SI,Watanabe J,Nakachi K,et al.Genetic linkage of lung cancerassociated MspⅠpolymorphisms with amino acid replacement in the hemebinding region of the human cytochrome P450 1A1 gene〔J〕.J Biochem,1991;110(3):407.

3 Belogubova EV,Ulibina YM,Suvorova IK,et al.Combined CYP1A1/GSTM1at-risk genotypesare overrepresented in squamous cell lung carcinoma patients but underrepresented in elderly tumor-free subjects〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2006;132(5):327-31.

4 李佳圆,龙启明.有机氯农药、CYP1A1易感基因型与乳腺癌的相互作用研究〔J〕.现代预防医学,2008;35(1):34-8.

5 Agundez JA.Cytochrome P450 gene polymorphism and cancer〔J〕.Curt Drug Metab,2004;5(3):211-24.

6 尹 琴,常福厚,王敏杰,等.蒙古族与汉族学生 CYP1A1基因多态性比较〔J〕.中国公共卫生,2009;25(9):1053-4.