三聚氰胺的毒性毒理及检测最新进展

朱丽萍，孙建全，颜世敢

（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，济南 250353；2.山东省农科院畜牧兽医研究所，济南 250100）

三聚氰胺的毒性毒理及检测最新进展

朱丽萍1，孙建全2，颜世敢2

（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，济南 250353；2.山东省农科院畜牧兽医研究所，济南 250100）

三聚氰胺是用途广泛的化工原料，含氮量高达66%，被不法分子作为蛋白替代品添加到乳品、饲料中，导致婴幼儿、宠物患泌尿结石甚至死亡。本文对三聚氰胺及其同系物的理化性质、代谢、毒性毒理、检测最新进展全面综述，并对其添加原因进行初步分析。

三聚氰胺；同系物；毒理；检测；色谱；质谱

0 引 言

2008年8月“三鹿牌”奶粉因含三聚氰胺导致6244名婴儿患泌尿结石6名死亡，一时国人“闻奶色变”。这场三聚氰胺风暴使中国的乳品业蒙受致命打击，也使食品安全问题再次引起人们高度关注。本文从三聚氰胺的理化性质、代谢、毒性毒理、检测方法等最新进展全面综述，使读者对三聚氰胺有一个正确的认识。

1 三聚氰胺的理化性质、用途

三聚氰胺（Melamine）是三嗪类含氮杂环有机化合物，分子式为C3N6H6或C3N3(NH2)3，分子量126.12。 为纯白色单斜棱晶体，无味，密度为1.573 g/cm3，常压熔点为354℃，快速加热至300℃升华。溶于热水，微溶于冷水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。一般情况下较稳定，高温下可能会分解释放出氰化物。与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等形成三聚氰胺盐。遇强酸或强碱溶液水解，胺基被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺(ammeline)、三聚氰酸一酰胺(ammelide)、三聚氰酸(cyanuric acid)，它们属同系物。

三聚氰胺是一种用途广泛的有机化工原料和中间品，主要用于生产树脂、涂料、塑料、黏合剂、阻燃剂等物质。

三聚氰胺被不法分子作为蛋白质替代品添加到乳品、饲料中，基于它满足以下条件：形态酷似蛋白粉，无异味，含氮量高达66%，远高于普通蛋白质的含氮量，慢性毒性不容易被发现，添加该品可引起凯氏定氮法测得的表观上蛋白质质量分数提高，产品质量“合格”，同时大幅降低生产成本。

2 三聚氰胺的毒性、毒理及代谢动力学

动物实验结果表明，三聚氰胺属低毒和实际无毒级物质，但长期或反复大量摄入导致产生肾与膀胱结石。目前尚缺乏人体研究的资料。2起案例证实了三聚氰胺的毒性。2007年中国出口美国的宠物食品中掺杂6.6%三聚氰胺导致约4000只猫狗死亡[1]。中毒的猫、狗表现为食欲下降、呕吐、多尿、多饮和嗜睡，氮质血症，结晶尿，管状坏死和血管周围纤维增生和炎性反应[2]。2008年8月，中国三鹿牌婴幼儿奶粉含三聚氰胺造成6244名婴幼儿患肾、输尿管结石病，6名肾衰竭死亡，患儿多为双肾多发性结石和输尿管结石，90%以上为尿酸盐结石。

2.1 急性毒性

小鼠经口的LD50为4550 mg/kg，小鼠经腹腔注射LD50为800 mg/kg。 雄性大鼠经口LD50为3160 mg/kg，雌性大鼠经口LD50为3850 mg/kg[3]，大鼠急性吸入的LD50为3248 mg/m3。 家兔经皮LD50为1000 mg/kg。 对家兔、豚鼠和人无眼刺激作用。根据现行食品急性毒性剂量分级标准，三聚氰胺属轻微毒性或实际无毒[2]。小鼠经口给予20 000 mg/kg三聚氰胺，9 h后出现不安、呼吸急促，死亡。死亡动物输尿管中均有大量晶体蓄积，部分动物肾脏被膜有一层晶体[4]。

2.2 慢性毒性

F344雄性大鼠连续饲喂含1%、3%三聚氰胺的饲料36周，结石发生率分别为70%和100%，膀胱癌的发生率分别为5%和79%，膀胱乳突状瘤的发生率为5%和63%，3%剂量组输尿管癌和输尿管乳突状瘤发生率分别为5%和16%。动物长期大剂量摄入三聚氰胺能引起生殖泌尿系统结石及诱发膀胱癌和输尿管癌[5]。

三聚氰胺对动物的毒性呈种属差异性，这与动物的饮食习性不同造成尿液pH值差异有关。肉食性动物猫、狗的酸性尿液促进三聚氰胺和三聚氰酸形成结晶。三聚氰胺对雄性动物毒性大于雌性动物。断奶大鼠摄入等量的三聚氰胺时结石发生率高于成年大鼠。结石发生率与三聚氰胺的摄入量呈明显的量-效关系，泌尿道中三聚氰胺呈过饱和时更易发生结石。

2.3 致癌性

多数认为三聚氰胺致癌是结石对粘膜的刺激，不是三聚氰胺或其代谢产物与膀胱上皮细胞之间的相互作用引起[6]。三聚氰胺是间接的非遗传毒性致癌物。国际癌症研究机构(IARC)认为，有充足证据表明三聚氰胺可导致实验动物发生膀胱结石，在这种条件下对实验动物具有致癌性，但三聚氰胺对人类的致癌性证据不足，将三聚氰胺列为Ⅲ级致癌物，即现有证据不能对三聚氰胺对人类的致癌性进行分级评价。

2.4 协同致病性

大鼠经口给予三聚氰酸的LD50为7700 mg/kg。三聚氰胺和三聚氰酸本身的毒性很小，但二者联合使用时毒性增加。成年猫单独给予0.5%和1%的三聚氰胺11 d和0.2%，0.5%，1%的三聚氰酸3～4 d未见明显肾功能损害，而联合给予0.2%，0.5%，1%三聚氰胺和三聚氰酸48 h出现急性肾功能衰竭，尿和肾中均见扇型折光晶体[7]。鱼、猪单独给予三聚氰胺和三聚氰酸 (400 mg/kg，3 d)时呈低毒性，相同剂量同时给予时肾结石大量形成，肾毒性增加[8]。在三聚氰胺的加工过程中混入三聚氰酸，或三聚氰胺进入机体代谢产生的少量三聚氰酸都会加剧三聚氰胺的毒性。

2.5 代谢动力学

三聚氰胺在机体内的代谢属不活泼代谢或惰性代谢，以原形或同系物形式从尿中排出。三聚氰胺在膀胱中的分布水平最高，然后是肾脏和血浆。三聚氰胺在大鼠体内经24小时90%以原形从尿中排出，尿中半衰期3 h[9]。猪静脉注射三聚氰胺，血浆中的半衰期为4.04 h[10]。大鼠、狗和人群志愿者经口摄入三聚氰酸后，均迅速被吸收和清除，以原形从尿中排出。

2.6 毒理学

三聚氰胺进入人体、哺乳动物胃后，在酸性环境中部分水解，胺基逐步被羟基取代水解生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸。当三聚氰胺和三聚氰酸同时存在时，二种分子的羟基与氨基之间形成水合键，将二者连接起来，这种连接反复进行，最终形成不溶于水的网格结构复合物，并沉积下来，形成结晶，阻塞输尿管，最终导致肾脏衰竭。因三聚氰胺死亡的宠物猫、狗体内发现了结晶的电子显微镜照片，体外实验也证实三聚氰胺和三聚氰酸的澄清溶液混合后瞬间反应形成结晶[11]。计算机模拟发现，三聚氰胺与三聚氰酸通过分子间氢键形成网状结构的三聚氰胺氰尿酸盐[12]。三聚氰胺致结石可能与其代谢产物三聚氰酸的存在有关[1,7,13]。

三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺的动物或人体毒代动力学资料未见报道。3种同系物与三聚氰胺的毒性差异尚不清楚。美国FDA假定这4种物质有同等的毒性效应，将它们统称为三聚氰胺相关物质(MARCs)进行总体毒理学评定。

3 三聚氰胺检测方法

三聚氰胺既不是药品也不是食品添加剂，正常情况下不应该出现在食品或饲料中。2007年以前国际上没有饲料和食品中三聚氰胺的检测方法和检测标准。2007年5月，美国FDA在发生宠物粮污染三聚氰胺后相继公布了GC-MS，HPLC，LC-MS检测流程，用于检测食品、饲料原料中的三聚氰胺及其相关物质[14，15]。2007年6月4日，我国农业部发布了《饲料中三聚氰胺的测定》农业行业标准，建立了HPLC和GC-MS法测定饲料中的三聚氰胺[16]。2008年10月7日《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》国家标准颁布，规定了原料乳及含乳制品的HPLC、LC-MS/MS、GC-MS三种检测三聚氰胺方法[17]。2008年10月15日发布了实用的国家标准《原料乳中三聚氰胺快速检测-液相色谱法》，使用离子交换柱，样品前处理和HPLC检测时间共约30 min[18]。除奶（奶粉、液态奶）、饲料外，鱼[15]、肉[19]、蛋[24]、含乳蛋肉的制品、面粉[20]、动物组织器官[21]等均有检测出三聚氰胺的报道。

实际检测中发现某些样品虽然没有检出三聚氰胺，但可以发现其类似物。我国只检测三聚氰胺，而美国、日本等国要求同时检测三聚氰胺及其同系物。胺和酸为二类化合物，很难同时分析，二次检测成本和时间不容许。美国FDA采用ZIC-HILIC色谱柱pH梯度和浓度梯度LC-MS法实现了二者的同时检测。

三聚氰胺的检测方法有色谱法、色谱-质谱联用法、ELISA、毛细管电泳法、改良凯氏定氮法、近红外吸收法等。

3.1 液相色谱法（HPLC）

从三聚氰胺的结构看，可以用气相色谱（GC）、液相色谱法（HPLC）对其检测。HPLC设备价格较低，灵敏度达1～2 mg/kg，适合大批量的检测，便于乳品生产加工企业普及，因而是我国的主流检测方法。缺点是样品需前处理，阳性结果无法定性分析，色谱柱需定期维护、更换。

HPLC检测的一般步骤：蛋白质沉淀——三聚氰胺提取——净化——HPLC分析。首先样品中加入三氯乙酸、醋酸铅、醋酸锌、亚铁氰化钾等蛋白质沉淀剂来除去蛋白质，然后以极性溶剂或缓冲液利用液液萃取、超声辅助提取、匀质提取等提取技术提取三聚氰胺，样品提取后再用强阳离子交换(SCX)、固相萃取(SPE)法进一步净化以提高HPLC检测的灵敏度，常用的阳离子交换固相萃取柱有Oasis MCX柱、Strata-X-C柱、SCX柱和Cleanert PCX柱等。师彦平利用氧化锆中空纤维柱对乳制品中三聚氰胺进行同步富集与萃取，然后用GC-MS法快速测定乳制品中三聚氰胺含量，检出限达0.001 mg/L。

HPLC检测通常有3种模式：（1）离子对模式。三聚氰胺及其同系物为强极性化合物，在色谱柱上几乎无保留，难以分离和检测。为延长其在色谱柱上的保留时间，一般在流动相中加入离子对试剂，与三聚氰胺形成中性离子对来改善分离条件，获得稳定的保留。国内多采用庚烷-磺酸钠、辛烷-磺酸钠、己烷-磺酸钠等离子对试剂。离子对色谱法操作简单，用常规的C18和C8柱在普通的HPLC仪上接紫外检测器(UVD)或二极管阵列检测器(DAD)可分析，保留时间较长，灵敏度较高。缺点是：平衡时间长，离子对试剂对环境不利，对色谱柱及色谱系统不利，不能接质谱，接质谱时改用挥发性的离子对试剂。HPLC反相色谱柱有Agilent TC-C18柱、Symmetry C18柱、Agilent Zorbax SB C18柱、ZORBAX Eclip se XDB-C18柱、Agilent Eclip se XDB-C8 柱、Zorbax Rx-sil C8 柱等。（2）强阳离子交换模式。三聚氰胺为阳离子，可采用阳离子交换法检测。我国国标就采用离子交换色谱法来检测三聚氰胺。优点是分离检测速度快，分离效果好，采用无机盐为流动相，不使用离子对试剂。缺点是不能上质谱。可选择的阳离子色谱柱有Dionex的IonPac CS17柱、SCX色谱柱及Grace-Vadyc的allsep柱、CS12A柱。混合柱有日本资生堂的SCX和C18混合柱、戴安的PCX-100及PCX-500阳离子交换和反相混合柱。（3）亲水性色谱法（HILIC）。可同时检测三聚氰胺和三聚氰酸。亲水色谱柱代表为Merck-Sequant的ZIC-HILIC柱、戴安公司HILIC和离子交换混合柱Acclaim Mixed-Mode WAX-1柱。流动相一般为乙腈与乙酸铵或醋酸铵的缓冲溶液，乙腈浓度越大，保留时间越长。优点是色谱的流动相与质谱兼容，可进行HPLC和HPLC-MS对照。美国FDA采用该法，国内极少用。

3.2 色谱-质谱联用法

质谱法具有定性的优势，是权威质检机关确认三聚氰胺的首选方法，样品先经色谱分析再经质谱分析。色谱-质谱联用法有LC-MS、气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质/质法（LC-MS/MS）、气相色谱-质/质法（GC-MS/MS）。 LC-MS对样品的前处理与HPLC基本相同，GC-MS的样品前处理相对简单，样品提取后不需净化，但需衍生。LC-MS/MS的定量限 为0.01 mg/kg，GC-MS的 定 量 限 为0.05 mg/kg，GC-MS/MS的定量限为0.005 mg/kg。

LC-MS法：选用亲水性的C18色谱柱，能延长保留时间。采用HILIC柱则保留时间更长，且HPLC和HPLC-MS兼容。 与GC-MS和HPLC相比，LC-MS的灵敏度最高，可对阳性样品进行确证，适于食品中三聚氰胺的快速定量分析。但设备昂贵，操作人需要高的质谱技术水平和操作经验，难以在基层推广。

GC-MS： 灵敏度介于HPLC和LC-MS/MS间[14]。样品需硅烷化衍生，繁琐费时，但能有效去除基质干扰，降低假阳性率，方法稳定[22]。GC-MS法可同时分析三聚氰胺及三聚氰酸，定量的同时还能确定被检测成分的分子式。仪器有Agilent 6890N GC-5975B MS联用仪,PerkinElmer Clarus 600T GC/MS联用仪等。国外GC-MS比较成熟，美国FDA对宠物食品、植物蛋白粉等采用GC-MS法检测。国内较少采用。

LC-MS/MS：美国FDA建立了基于HILIC的LCMS/MS法，实现复杂食品基质中痕量三聚氰胺的定量检测，检测鲶鱼中三聚氰胺残留的灵敏度达0.01mg/kg，符合率为76.3%[15]。 仪器有Agilent HP1100 HPLC-三重四极杆质谱联用仪、Thermo Scientific的Accela HPLC-TSQ Quantum Ultra三重四极杆质谱仪、Agilent 6410 HPLC-三重四极杆质谱仪。

3.3 ELISA

ELISA检测设备便宜、操作简单，高通量检测，可用于三聚氰胺的快速、定量检测，检测范围为20-500 ng/ml，检测时间不超过2小时，能满足地方质检部门、小型食品企业及奶站的需求。缺点是ELISA只能定量检测，不能定性分析，检测过程中有假阳性。商品化的三聚氰胺ELISA检测试剂盒的生产厂家有Beacon Analytical Systems，Abraxis，Strategic Diagnostics等 。 美 国FDA验 证 发 现Abraxis的Melamine Plate kit检测灵敏度为9 μg/L，Strategic Diagnostics的EnviroGard Triazine Plate kit的灵敏度为1.5 g/L[23]。中国农科院也研制出ELISA检测试剂盒。

3.4 毛细管电泳法（HPCE）

毛细管电泳兼有电泳和色谱的特点，操作简便、分析快速、稳定可靠且经济环保，分析成本低，使用的缓冲溶液全部为水相，不需要特殊的色谱柱，使用普通的毛细管，毛细管和缓冲液的价格低，进样量、消耗的缓冲液少（只需1 mL），比HPLC经济环保、分离效率高，完成一次操作不超过20 min。但灵敏度比HPLC低。饶钦雄利用毛细管电泳法检测鸡蛋中三聚氰胺，分离时间约6 min，测得的定量限为0.25 mg/kg[24]。

3.5 改进的凯氏定氮法

凯氏定氮法的缺陷是不能区分真、假蛋白氮，只要对其稍加改进，用三氯乙酸沉淀样品中蛋白质，过滤后，分别测定沉淀和滤液中的氮质量分数，就可知道真蛋白质的质量分数和假蛋白的氮质量分数。牛奶中氮质量分数的国际标准(ISO8968-5)[25]和《乳与乳制品中非蛋白氮质量分数的测定》国家标准就建立在此基础上[26]。

3.6 近红外吸收检测法

近红外吸收法对样品前处理要求低，可进行非破坏式的在线分析，但设备价格昂贵，需要不断进行校准，不同样品基质中的干扰是困惑红外分析精度、重现性的一大障碍。Polychromix的Phazir手持式近红外分析仪、Thermo Scientific的Spectra-Quad在线成分分析仪可实现无接触、无损伤和无危害的检测，分析结果不受蛋白质质量分数变化的影响。

4 结束语

总之，2008年的三聚氰胺风暴已经平息，但曝露出的问题值得反思。乳品中添加三聚氰胺具有一定的必然性。比如我国生鲜牛奶执行的1986年制定的检测标准不适应形势发展需求；乳品加工企业对原料乳的检测手段落后；牛奶的生产、加工，涉及农业、质检、工商、卫生多个部门，分段监管，职责分工不明确。

在当前市场监管不足，食品检测手段落后，法律法规存在漏洞的情况下，不法分子只要有机可乘，三聚氰胺仍有可能会卷土重来，其他与三聚氰胺类似的物质也有可能被添加进来。因此对食品中添加物的检测要提高警惕，举一反三，食品安全警钟长鸣。

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Toxicity,toxicology and detection methods of Melamine

ZHU Li-ping1,SUN Jian-quan2,YAN Shi-gan2
(1.School of Food and Bioengineering,Shandong Institute of Light Industry,Jinan 250353,China;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan 250100,China)

Melamine is a common chemical raw material with a wide range of application,it is added into dairy products,animal feed as a protein alternative by the lawless because its nitrogen content reaches as high as 66%,resulting in infants and pet cats and dogs suffering from urinary tract stones even death.In this paper,physical and chemical properties,metabolism,toxicity,toxicology,detection methods of melamine and its homologues was overviewed.The adding reason of melamine was also preliminarily explained.

Melamine;homologue;toxicology;detection;chromatography;mass spectrum;

TS252.7

A

1001-2230（2010）03-0051-04

2009-11-10

山东省农业重大应用技术创新课题“规模化奶牛饲养场疫病控制技术研究”。

朱丽萍（1972-），女，讲师，研究方向为食品微生物与生物技术。

颜世敢