寄生虫MicroRNA的研究进展

徐民俊，贺现辉，朱兴全*

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州730046)

寄生虫严重危害人和动物的生命及健康，并造成巨大经济损失。目前，对人和动物寄生虫病的防治仍然主要依靠使用抗寄生虫药物。在养殖业中，由于抗寄生虫药物的长期过度使用造成的寄生虫抗药性问题及动物产品和环境中的药物残留问题，已引起人们的关注，并一直在寻找更为有效的防治寄生虫病的新途径。1993年在秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)中 MicroRNA(miRNA)lin-4以及let-7的发现为寄生虫的转录后调控研究提供了新的契机[1-2]。miRNA是一类内源性非编码的小RNA，在动物中来源于长度约70 bp～90 bp的前体。前体经过双链RNA特异性的RNaseⅢ-Drosha及RNaseⅢ-Dicer和AGO作用，最终形成18 nt～22 nt长度的成熟miRNA[2-4]，然后通过与靶mRNA 3'端非翻译区(UTR)结合导致靶基因翻译阻遏或者降解，实现转录后抑制调控[5-6]。

复杂的生活环境、不同的生活形态和周期以及性别分化均表明，寄生虫具有非常复杂的基因表达调控系统。开展寄生虫miRNA研究不仅有利于了解对寄生虫生活史，而且有助于发现新的药物作用靶标或设计新的核酸疫苗，为有效防治寄生虫病提供新的途径。本文对寄生虫miRNA的研究进展进行综述，以期为寄生虫的深入研究提供参考。

1 寄生蠕虫

1.1 日本血吸虫(Schistosoma japonicum) Xue等在日本血吸虫中发现了5种新的miRNA，其中4种具有保守性的 miRNA(sja-let-7，sja-miR-71，sja-miR-125 和 sja-bantam)，1种(sja-miR-new1)为血吸虫特有。对这5种新的miRNA在日本血吸虫6个发育期中表达情况的分析表明，这些miRNA表现出高度的期特异性[7]。

对秀丽新杆线虫和果蝇的研究表明，let-7具有很强的时序调控特性，主要在幼虫发育后期表达，在幼虫向成虫的发育阶段非常关键，而其调控机制会受到其它因素(如蜕皮激素或蜕皮激素合成过程的中间产物)的影响[8]。在日本血吸虫研究中发现的let-7均表现为高度的期特异性；其表达量在毛蚴期非常低，而胞蚴期为毛蚴期的12倍，在尾蚴期达到高峰。因此，推测let-7在中间宿主钉螺中与毛蚴至尾蚴的发育调控相关[7]，但尚未得到实验证实。

另外两种miRNA sja-miR-71和sja-bantam的表达情况与let-7类似，都是在毛蚴期开始表达，在尾蚴期达到高峰。而尾蚴是血吸虫的感染期，当尾蚴进入宿主动物细胞后，sja-miR-71的表达立刻降到最低水平然后进入童虫期，并在此后的生命活动过程中始终保持在较低的水平。sja-miR-71在尾蚴期的表达量高于童虫期近1 000倍，sja-bantam则高达近500倍。这种表达量的变化只与生活周期变化相关，与性别无关[7]。由于寄生虫在感染宿主之前必然有基因表达模式的改变和相关的蛋白表达，miR-71和bantam的变化规律似乎表明这两种miRNA与尾蚴入侵宿主细胞相关的基因调节活动密切相关。

值得注意的是，miR-71和bantam及其前体都是高度保守的。根据Sanger miRBase数据库(Version11.0，http://www.mirbase.org/)登录的数据，miR-71不唯寄生虫独有，也存在于其它物种中(包括人类、小鼠、蜜蜂、蚕、涡虫等)。不过，目前尚未见到miR-71在植物和病毒中的报道，是否miR-71只存在动物中还有待研究。此外，miR-71在不同物种中通常都具有很大的家族，包括miR-71a、miR-71a-1、miR-71b和 miR-71c等。Bantam存在于果蝇、蚕和涡虫等节肢动物和无脊椎动物中，在哺乳类动物及植物中未见报导。除此之外，在果蝇中的研究也已表明，bantam通过对hid基因的调控影响细胞的增殖和凋亡，bantam的沉默导致细胞增殖能力降低或者凋亡速度增加，减少内源性bantam编码基因导致hid基因表达量上升，而增加内源性bantam编码基因则反之[11]。这些现象表明，miR-71和bantam在寄生虫侵染宿主相关的转录后调控过程中似乎并不是关键因素，其表达量的提高很可能与寄生虫细胞的基础生理代谢有关，即当寄生虫感染宿主时，相关基因大量表达，所需要的基础代谢随之提高，相应地激发了miR-71的表达，以对基础代谢进行精确调控。这表明miR-71和bantam与生长发育密切相关，但是否作为寄生虫侵染宿主的调控因子仍然有待进一步研究。

此外，基础代谢率的提高是否能引起寄生虫的miR-71或bantam表达量的相应提高，或者通过RNA沉默技术下调miR-71或bantam的表达从而导致其基础代谢的紊乱，抑制幼虫发育甚至阻碍尾蚴对宿主侵染，有关这方面的研究目前尚未见报道。如果假设成立，通过RNA沉默技术阻碍相关miRNA，尤其let-7、miR-71或bantam的表达将为控制寄生虫发育和感染提供一条新途径。

1.2 曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni) Gomes等通过生物信息学分析方法发现了曼氏血吸虫SmDicer1和SmAgo2/3/4蛋白编码基因并在尾蚴、成虫、卵和体外培养的曼氏血吸虫中对其表达进行了验证，结果表明SmDicer1和SmAgo2/3/4在不同发育阶段表达水平不同，推测miRNA的调控可能是在转录水平上进行的，并借此对曼氏血吸虫生活史的不同发育阶段进行调控[9]。曼氏血吸虫的Dicer基因(SmDicer)长度超过了54 kb，包含30个外显子，可以编码一个2 641氨基酸残基的蛋白质，是目前已知最大的Dicer蛋白[10]。Dicer和AGO蛋白的发现进一步表明在血吸虫中存在miRNA调控体系。

此外，在血吸虫中发现的miRNA还包括：Copeland等通过生物信息学手段从曼氏血吸虫中发现的1种miRNA(miR-124)，该miRNA也存在于日本血吸虫中。同时发现的另外一种miRNA(miR-287)，似乎只存在于曼氏血吸虫中。在与血吸虫遗传距离较远的涡虫(Schmidtea mediterranea)中发现的71种miRNA中，miR-124及miR-749在血吸虫的两个种中均保守存在[12]。

2 寄生原虫

2.1 蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia) AGO蛋白在蓝氏贾第鞭毛虫发育过程中起重要作用，它可以特异性地与m(7)G-帽子结合，从而协助miRNA介导的转录抑制调控。现在已经明确，蓝氏贾第鞭毛虫的至少4种miRNA来源于细胞内的小核仁RNA(Small nucleolar RNA，snoRNA)。在Dicer的作用下，snoRNA GlsR17被加工为26 nt大小的miRNA(miR2)。荧光素酶(Luciferase)基因在其 3'端包含6个与miR2作用位点一致的序列，将该酶的mRNA与人工合成的miR2共同温育，则导致荧光素酶的表达量下降40%，而mRNA的稳定性并不受影响。因此，miRNA的转录调控很可能是通过翻译阻遏而不是mRNA降解完成的。通过核糖体反义RNA抑制蓝氏贾第鞭毛虫AGO蛋白的表达，荧光素酶的合成则不会受到影响。另一方面，Dicer基因的沉默则会导致细胞中snoRNA不能被分解，相应miRNA在细胞中的含量急剧降低。同时变异表面糖蛋白(Variant surface glycoprotein，VSG)表达不受限制，由单一表达变成多表达，表明调节蓝氏贾第虫的抗原变异是miRNA的沉默调节功能之一[13-14]。

蓝氏贾第鞭毛虫是miRNA研究中第一个经过克隆和实验验证的原虫。起源于snoRNA的具有miRNA功能的小RNA的发现扩展了寄生原虫的调节性小RNA的来源。该研究首次提出miRNA来源于snoRNA，而不是由miRNA基因本身编码，意味着在miRNA介导的基因沉默过程中很可能有我们尚未发现的新途径[15]。这种现象也意味着在寄生虫和宿主中起源于其它含量丰富的RNA分子(如 rRNA，tRNA和 snRNA)并且与 AGO相关的小 RNA很可能也具有调节基因表达的功能。

2.2 布氏锥虫(Typanosoma brucei) Mallick等预测了1 889个成熟的miRNAs，以及这些miRNA潜在的VSG作用位点[16]。在布氏锥虫的基因组中也发现了类似Dicer编码基因功能的序列，Dicer编码基因和预测的miRNA意味着在锥虫中存在着miRNA调节的功能性网络。此外，在布氏锥虫中发现了一些siRNA(Small interfering RNA)，具有类似miRNA功能，可以导致相关mRNA的降解。与miRNA不同，这些siRNA长度约25 nt，来自于长的dsRNA，并且具有转座子(transposon)特性[17-18]。

2.3 阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis) Lin等从阴道毛滴虫中发现了9种miRNA。这9种miRNA在其它22种原虫基因组中至少存在一个同源miRNA拷贝，其中miR-006高度保守。但是在溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、利什曼原虫(Leishmaniaspp.)和锥虫中未发现任何同源性。除此之外，在阴道毛滴虫中至少存在两种AGO蛋白(tvAGO1和tvAGO2)，AGO蛋白的发现证明了miRNA在阴道毛滴虫中的调控是确实存在的[19]。由此可见，寄生虫基因表达调控机制以及miRNA的种类在某些物种间具有较大的差异。

2.4 疟原虫(Plasmodium) 虽然在疟原虫中发现了转录后抑制现象，并且找到了mRNA保守的3'端非翻译区，但是却没有发现与miRNA调节作用相关的Dicer和AGO相关蛋白基因[20-22]。此外，不同研究者从被疟原虫感染的红细胞中均只发现了大量的人类miRNA(以miR-451为主)，而在纯化的疟原虫中没有发现任何miRNA或者siRNA，而且miR-45似乎只与红细胞成熟分化以及形态维持相关，与疟原虫感染与否无关[23-24]。这似乎意味着疟原虫具有不同的调控机制。

2.5 溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica) De等从溶组织内阿米巴中预测了17个miRNA，并且从该寄生虫的基因组中发现了与miRNA调控相关的AGO及Dicer蛋白的相关编码基因[25]。这些miRNA的功能可能包括参与GTP-结合蛋白(miR-2a)、蛋白激酶(miR-3a)和Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(miR-15b)的作用等。

3 节肢动物

3.1 按蚊(Anophelesspp.) Mead等在17日龄的雌性斯氏按蚊(A.stephensi)中分离到27种miRNA，7种与冈比亚按蚊(A.gambiae)的miRNA具有同源性，4种为新发现的miRNA(miR-x1-miR-x4)，这些miRNA对斯氏按蚊从晚期胚胎到成虫的发育非常关键[26]。在4种新发现的miRNA中，miR-x2在斯氏按蚊和埃及伊蚊(Aedes aegypti)中保守，并且主要分布在卵巢中，在按蚊饱食血液72 h之后，表达量急剧下降，因此推测其功能在不同种类的蚊科中均与生殖调控相关。miR-14在按蚊胚胎晚期到成虫的发育过程中表达量非常高(占测序miRNA数目的25%)，并且此后在按蚊成虫一生之中持续表达，这种表达与性别、年龄和进食过血液与否无关。由于其在果蝇中与细胞寿命和凋亡密切相关，因此推测其对按蚊生活史各个阶段的生长发育调控至关重要。

Winter等从感染疟原虫后的冈比亚按蚊中分离到18种miRNA[27]。其中12种在虫体的各个部位分布均匀，并且与性别无关，而其它6种则与消化系统紧密关联。疟原虫存在与否会直接影响到其中4种miRNA的表达模式，当疟原虫感染时，在疟蚊中肠中Aga-miR-34，A-ga-miR-1174和Aga-miR-1175表达量均下降超过 50%，Aga-miR-989则升高了近4倍。同时，在其它组织和器官中Aga-miR-989表达量则下降了60%。通过dsRNA对Dicer1和AGO1基因进行的沉默研究发现，当Dicer1和AGO1不存在时疟原虫对疟蚊的感染敏感性增加。由此推断，miRNA在疟蚊的抗疟原虫感染方面发挥着重要作用。

3.2 肩突硬蜱(Ixodes scapularis) Wheeler等在研究物种进化的过程中，获得肩突硬蜱的32种miRNA，并被Sanger miRBase数据库收录[28]。这 32种 miRNA与 miRBase数据库收录的其它寄生虫，包括日本血吸虫(5种)，曼氏血吸虫(5种)以及按蚊(66种)miRNA序列相比，只有bantam，let-7，miR-71，和miR-125等4种miRNA是保守的。同为节肢动物，肩突硬蜱与疟蚊之间有24种保守miRNA。

4 小结与展望

目前发现的寄生虫miRNA主要为表达丰度高和分布广的种类，例如let-7，miR-71和bantam等；而表达丰度低、呈期特异性的miRNA发现的很少；已发现的miRNA主要与生长发育相关，与寄生虫侵染宿主相关的关键miRNA尚未见报导。此外，尽管目前在寄生虫中预测的miRNA已经接近2 000种，但是多数miRNA的具体功能仍然有待实验验证。

据估计，细胞中miRNA总数占基因组所有编码基因的1%～3%，因此其在生长发育和形态调控中必定有着巨大作用等待深入研究。绝大多数miRNA的表达具有发育阶段的特异性、时序性或组织特异性，这也从侧面说明了其在基因调控方面的作用[2,29-30]。目前已经发现的寄生虫miRNA表明，miRNA广泛地参与了寄生虫发育过程的生理代谢过程，但是其具体的作用机理仍然有待深入研究。

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