弓形虫抗原表位研究进展*

王艳华,殷 宏,张德林,付宝权

弓形虫抗原表位研究进展*

王艳华,殷 宏,张德林,付宝权

弓形虫是一种呈全球分布的专性细胞内寄生原虫,广泛寄生于人和动物的有核细胞内,能引起严重的人兽共患寄生虫病。因此,对弓形虫及弓形虫病的研究日趋得到学者们的重视。由于弓形虫生活史较复杂,抗原成分多,每种抗原在体内诱导的免疫效应不同,实验证明,单价亚单位疫苗免疫效果和单一抗原诊断试剂检测效果均不理想,研制多表位疫苗和诊断试剂必然是一个新的发展趋势。因此,正确而详细地了解蛋白质表位对疾病的诊断以及设计疫苗分子结构具有重要理论和现实意义。本文就弓形虫表位研究进展加以综述。

1 抗原表位及分类

抗原表位(epitope)又称抗原决定簇(antigenic determination),是指抗原分子上能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能够被其识别的一个免疫活性区。免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个蛋白质分子,而仅识别抗原肽分子上的表位,严格来说,抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子的〔1〕。表位一般只占5～7个氨基酸或单糖残基的大小,最多不超过30个氨基酸残基。按与抗原受体细胞结合不同,分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位;按表位结构不同分为连续性抗原表位和非连续性抗原表位,前者又称线型表位,是由肽链上顺序连续的氨基酸组成,后者又称构象型抗原表位,是由空间邻近但顺序上不连续的氨基酸组成〔2〕。线型表位多见于T细胞表位,也可见于B细胞表位,构象型表位只见于B细胞表位。

一个蛋白质抗原,它不但含有与免疫识别密切相关的B细胞、T细胞、CT L细胞、NK细胞等表位结构,同时还含有一些对于保护性免疫不利的结构。此外,表位间的相对位置、构象特征、表位侧翼顺序等与表位功能的表达密切相关。再有MHC限制位(Agretope)、组织位(Histotope)等相关结构对表位的功能表达亦具有影响。许多研究发现,天然蛋白质在引发免疫反应时,不能满足清除病原体的需要。究其原因,一是因为隐匿的保护性表位功能未能表达,因而所引发的保护性免疫不够强大。二是所引发的免疫反应发生了免疫偏移(Deviation),甚至造成T、B细胞间或T细胞亚群间互相残杀从而加重感染。因此,对于抗原性的研究不得不从天然抗原整个分子水平向表位水平过渡。另外,就同一表位而言,表位内氨基酸残基对抗原性的贡献也有不同,表位内各氨基酸残基的组成和顺序决定了抗原的特异性〔3〕。

2 弓形虫抗原表位研究方法

2.1 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是Smith等〔4〕于 1985 年创建的 。1988 年 Parmley 等〔5〕提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原表位的设想。1990年Scott等〔6〕首次将噬菌体随机肽库应用于抗原定位,自此,国内外学者进行了大量的相关研究。

噬菌体展示技术是研究蛋白抗原表位的强有力工具,利用随机肽库中可以同时获得蛋白抗原线型表位和构象型表位,而且这种方法不必预先确定蛋白质的氨基酸序列。其基本原理是将待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区,使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面,并保持特定的空间构象,然后通过特异性亲和作用来筛选特异性蛋白或多肽。这项技术被广泛应用于弓形虫抗原表位研究,极大地推动了弓形虫抗原表位的研究进程。

2001年Beghetto等〔7〕首次用孕妇患者血清筛选弓形虫cDNA λ噬菌体展示文库,对筛选出来的阳性克隆进行序列分析,发现与弓形虫致密颗粒抗原GRAl的序列相一致,利用抗体反应实验证实存在一个24肽优势免疫表位。

2003年Beghetto等〔8〕利用患者血清筛选弓形虫cDNA λ噬菌体展示文库,获得了GRA3、SAG1、GRA1、GRA7、GRA8和 MIC5的B细胞表位。而且,还鉴定了编码GRA3和MIC3基因的两个免疫显性区。2002年 Robben等〔9〕将弓形虫基因组DNA＜500bp的短基因片段插入到丝状噬菌体M13基因Ⅲ区,构建了弓形虫全基因噬菌体文库,用抗GRA3的单克隆抗体筛库,得到GRA3的抗原表位。

国内,2003年吴翔〔10〕等以纯化的弓形虫免疫兔血清IgG筛选噬菌体随机12肽库,获得的27个克隆中有24个能与弓形虫单克隆抗体及免疫兔血清发生反应,混合最强的4个阳性克隆免疫小鼠,1月后用致死量弓形虫攻击感染,其存活时间明显长于对照组。2004年林绮萍等〔11〕用同样的方法对弓形虫表位进行了筛选,获得了弓形虫抗原的有效模拟表位,对其中的一个阳性克隆插入的肽段进行序列测定,其序列为 5'- CTTCAGT TGGATCGGGCTCCGT TT TGGAAT CAGGGT-3',对应氨基酸序列为:LQLDRAPFWNQG,与Gen-Bank的弓形虫已知序列无一级结构的同源性,对表位的免疫保护效果研究表明获得的表位能诱导对弓形虫的部分保护作用。

噬菌体展示技术凭借着自己独特的优势,在生物科学研究和应用中的前景已经逐渐地显现出来。其优点是:①生产成本低廉。由于不需复杂费时的后期纯化过程,使成本大大降低。②噬菌体颗粒稳定性好,非常适用研究和应用。③可模拟天然多肽表位结构或功能。④噬菌体作为表位载体在无佐剂的情况下具有较好的免疫原性。

2.2 抗原表位预测法 采用免疫信息学方法对抗原表位进行预测已成为表位定位必不可少的工具,可减少盲目性,提高表位预测的准确性,大大降低实验费用,是一种经济而有效的方法。

1994年 Godard等〔12〕利用软件对 SAG1表位进行预测,然后合成这些表位(48～67,82～102,213～230,238～256和279～285肽)并对这些表位进行了鉴定。发现238～256肽存在T细胞表位。在不需要任何载体蛋白的情况下,不管是通过口服还是肌肉注射进行免疫,这种肽均能诱导B细胞和T细胞免疫反应。

1996年Saavedra等〔13对弓形虫 ROP2表位进行预测,选出一些表位(197～216、393～ 410和501～524肽)人工合成,以弓形虫ROP2特异性人 T细胞克隆(TCC32)识别合成肽。获得2个T细胞表位(197～216和501～524肽)。

2007年曹利民等〔14〕应用BioSun软件对6个目前研究较多的弓形虫主要抗原分子SAG1、SAG2、SAG3、GRA 1、GRA6和P35中的B细胞表位进行了预测,并从每个分子中选出2个抗原性较高的表位。构建了12个原核表达质粒,有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;经Western blot鉴定,获得3个弓形虫B细胞表位,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。

2008年张玉英等〔15〕利用生物信息学软件对SAG3基因结构和功能进行预测分析,推测SAG3的氨基酸功能域可能位于65～198位与206～326位之间。

尽管许多预测表位的免疫信息学方法已被建立和应用,但由于机体内免疫应答机制的复杂性,表位预测还不能完全反应体内实际情况;而且许多预测方法存在一定的局限性,有待完善。相信随着免疫学、信息学、分子生物学各领域的研究人员密切合作,表位预测的研究将取得突破性进展。

另外,还有些学者将基因分段进行表达,然后利用单抗或多抗来筛选出能引起阳性反应的片段,以获得抗原表位。

1993年 Murray等〔16〕对弓形虫 GRA2 C 末端59氨基酸的片段研究发现它至少存在3个B细胞表位。

1998年 Mevelec等〔17〕对截短的弓形虫 GRA4抗原性和免疫原性进行了研究,发现其C末端的11个氨基酸存在一个主要的B细胞表位,第二个B细胞表位识别的频率较低,位于318～334氨基酸,在N端25～276的氨基酸序列中没有明显的B细胞表位存在。

2003年李越希等〔18〕根据弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列,通过计算机分析,筛选出其中较强的抗原表位,用PCR方法分别扩增了内含这两种蛋白抗原表位的基因片段,成功的构建含两者抗原表位的融合蛋白工程菌并进行了表达,ELISA法证实该蛋白有较好的抗原性和特异性,可用作抗原检测弓形虫抗体。

3 弓形虫抗原表位研究的应用

3.1 弓形虫多表位疫苗研究 人工设计的复合多表位疫苗可预防疾病的各个阶段或同时预防多种疾病,因而被认为是将来疫苗发展的理想方向。在弓形虫表位疫苗研究方面,国内外都进行了大量的研究工作,既有单个表位疫苗功能的研究有又多表位疫苗的研究。

2007年,范久波等〔19〕采用生物信息学方法对新基因2B9G1、7C3-C3进行表位预测,PCR扩增编码3个表位的基因片段,构建了单表位、双表位、多表位疫苗质粒,但遗憾的是其保护性如何未见报道。

2008年,谭逵等〔20〕对弓形虫新基因wx2进行表位分析预测,制备了新基因的单表位核酸疫苗和双表位核酸疫苗。结果3种新基因的表位疫苗均能产生一定的保护效应,使实验小鼠的存活时间明显延长,且双表位疫苗优于单表位疫苗。证实DNA类表位疫苗的研制可作为弓形虫疫苗研究的策略之一。

2008年丛华等〔21〕将已知的弓形虫主要抗原SAG1、GRA1 、ROP2和GRA4的表位串联起来,制备了多表位核酸疫苗并对其进行了评价。结果证实该疫苗能引起重要的体液免疫和细胞免疫反应并能延长用致死量的 RH株速殖子感染小鼠的存活时间。

史霖等〔22〕构建成含 SGA1、GRA1、GRA4 和GRA2多个T、B细胞表位的弓形虫DNA疫苗。以该多表位DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,可诱导其产生特异性的体液和细胞免疫应答,免疫小鼠对致死剂量弓形虫 RH株速殖子的感染攻击具有部分抵抗作用,免疫小鼠存活期显著延长。

多表位疫苗与传统疫苗相比有很多优势,首先其安全性好,且诱发的免疫应答针对性强。其次,表位疫苗能剔除免疫反应中的某些不利因素,如负性调节的基因及非特异性成分,以及可以避免完整抗原与宿主同源性而引起的自身免疫反应等危害。表位疫苗也可通过选择适当的免疫方式,能诱导机体产生很强的细胞免疫,这对细胞内寄生的弓形虫尤其重要。

3.2 弓形虫多表位诊断试剂研究 由于弓形虫在人体和动物中寄生呈多阶段性,而不同阶段虫体的抗原具有特异性,所以以单一抗原尤其是阶段特异性的单一抗原制备的试剂盒,对弓形虫病进行检测容易出现漏检现象。从弓形虫某些特异性抗原,尤其是不同阶段虫体共有抗原中选出优势抗原表位,将它们串联起来进行表达,获得基因重组多表位抗原,用其作为诊断抗原检测弓形虫病理论上有望克服漏检现象。国内外学者对多表位抗原在弓形虫免疫检测中的应用前景进行了探讨。

2003 年 Beghetto 等〔23〕用含有 GRA3、SAG1、GRA1和GRA7表位的重组抗原建立了弓形虫IgG抗体亲和力试验,可以区分孕期弓形虫急性和隐性感染。

国内,杨培梁等〔24-25〕用含 SAG1、ROP2、GRA2抗原表位重组可溶性抗原建立ELISA方法,对兔和小鼠的急慢性弓形虫感染血清进行了检测。结果检测的141份小鼠血清,其中慢性感染弓形虫小鼠血清117份、正常小鼠血清24份,检测体系的敏感性为88.88%,特异性为91.67%,一致性为89.36%。检测的24份兔血清,其中急性感染弓形虫兔血清18份,正常兔血清6份,阳性血清检出率为94.4%,总一致性为91.5%。证明以弓形虫多表位重组抗原构建的ELISA试剂盒既可以检测弓形虫急性感染血清,又可以检测弓形虫慢性感染血清,具有一定的应用前景。

4 小 结

多表位抗原在对抗原成分选择上具有多样性,在具体操作上也因各种先进的分子生物学手段和完善的基因工程技术而具有可行性。但截止到目前,尽管已设计出了一些多表位肽疫苗和诊断试剂,但仍存在一些问题需要解决:①多肽单独应用其免疫原性较差,可能是因为外源多肽在体内降解较快。②抗原表位的选择,怎样才能选择出能使机体获得最佳免疫保护或适用于检测急、慢性诊断试剂的抗原表位,目前缺乏实验和理论依据。③免疫佐剂的使用,特别是新型免疫佐剂如CpG和QS21如何与抗原表位联合应用才能取得最佳效果,尚待进一步研究。④对于CD1呈递和直接呈递尚缺乏寻找表位的方法。⑤缺乏合理弓形虫疫苗评估方法。在自然条件下多是以缓殖子、包囊和卵囊的形式感染宿主,引起宿主的慢性感染。而选用强毒株速殖子进行攻击感染,常常引起的是实验动物的急性感染死亡,因而不能全面客观评估疫苗的保护性。另外,攻击剂量也值得进一步进行研究。

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R531.8

A

1002-2694(2010)01-0084-04

*国家科技支撑计划项目(2007BAD40B05)

张德林,Email:zhangdl2005@163.com

1.中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046

2009-06-11;

2009-11-07