牛分枝杆菌Mb2277蛋白的表达及其反应原性初步研究＊

刘 芳,朱建国,华修国,高 谦,严懿嘉

牛分枝杆菌Mb2277蛋白的表达及其反应原性初步研究＊

刘 芳1,朱建国1,华修国1,高 谦2,严懿嘉1

目的 构建牛分枝杆菌M b2277基因的原核表达载体,获得高纯度的融合表达蛋白,并对其表达产物的免疫原性进行初步研究。方法根据GenBank提供的M.bovis M b2277基因序列设计引物。以牛分枝杆菌(93006)DNA为模板,通过PCR方法扩增出M b2277基因片段,以Bam HⅠ和 Eco RⅠ双酶切PCR产物和p ET28a(+),后将纯化的M b2277基因克隆至p ET28a(+)中,构建出原核表达质粒,再转化到 E.coli BL21(DE3)表达菌株中,IPTG诱导后,收集菌体进行 SDS-PAGE,进一步利用Western Blot对表达产物的反应原性进行研究。结果获得了牛结核分枝杆菌M b2277原核表达质粒,IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约25ku蛋白表达条带,Western Blot结果显示,表达产物与兔抗分枝杆菌抗体具有反应性。结论该蛋白具有较强的反应原性。

牛分枝杆菌;分泌蛋白;M b2277基因

牛结核病主要是由牛分枝杆菌(M ycobacterium bovis,M TB)引起的一种人兽共患传染病,它严重危害人类的健康和畜牧业的发展并且导致很大的经济损失〔1-2〕。牛结核病的防制主要是采用牛结核菌素PPD进行变态反应诊断,然后对诊断出的阳性牛进行隔离或捕杀,以达到消灭该病的目的。但是,应用该防制措施并未达到控制该病的目的,反而近年来呈上升趋势〔3〕,主要是由于缺乏快速准确的诊断方法。近10年来,人们对结核分枝杆菌培养滤液中的分泌蛋白进行了广泛的研究,发现一些分泌蛋白不但是具有保护性功能的重要抗原,更是能用于研制诊断方法的候选选靶分子〔5〕。Rosenk rands〔5〕等运用双向电泳对结核分枝杆菌蛋白质组进行分析,发现M b2277存在于培养滤液中,证明该蛋白也是一种分泌蛋白。因此,本文对牛分枝杆菌M b2277基因进行克隆,构建其原核表达质粒及在大肠杆菌中进行表达,进一步分析其免疫原性,为研究新型疫苗奠定基础。

1 材 料

1.1 菌株和质粒 牛分枝杆菌 Mycobacterium bovis标准菌株(93006)由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所惠赠。大肠杆菌BL 21、p ET28a(+)质粒由中国农业科学院上海寄生虫研究所苑纯秀博士惠赠。

1.2 阳性血清 牛分枝杆菌接种于Sauton培养基,37℃培养14 d后,65℃灭活30 min,将培养滤液用PEG6000浓缩后,分3次免疫家兔,心脏采血收集血清。-20℃保存备用。

1.3试剂 PCR试剂、限制性内切酶 H in dⅢ、Bam HⅠ、T4 DNA 连接酶、DNA M arker DL 2000、DL 15000为大连宝生物工程有限公司产品;质粒小量回收试剂盒、胶回收试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的抗体购自上海鼎国生物有限公司;X放射自显影中的发光剂,显色剂购于 Pierce公司;其余常用化学试剂均为国产分析纯产品。

1.4主要仪器 Bio-Rad水平电泳仪(Laboratories);转移电泳槽(上海康达电子仪器厂生产)。

2 方 法

2.1 DNA的提取

2.1.1 M.bovis DNA的提取 将 M.bovis接种于Sauton培养基中,37℃培养4周后,100℃灭活10 min。按照革兰氏阳性细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒提供的说明书进行DNA的提取。

2.1.2 质粒DNA的提取 本实验中所有质粒均按照质粒小量回收试剂盒提供的说明书进行提取。2.2 引物设计与合成 根据 GenBank提供的 M.bovis M b2277基因序列,采用引物设计软件Primer Premier 5.0设计如下2对引物,在上、下游引物的5’和3’端分别加上 Bam HⅠ和 H indⅢ酶切位点。P1:5’-A TGTCCGGTCACCGCAAG-3’;P2:5’-TCAGCCAACGA TCGGTTTG-3’引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成。

2.3 目的基因M b2277PCR扩增及纯化 以牛分枝杆菌DNA为模板,以P1、P2为引物,对M b2277基因进行 PCR扩增。扩增条件为:94℃5 m in;94℃1 min,60℃1 min,72℃1 min,共 30个循环;72℃延伸10 min,4℃终止反应。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析,并按照DNA胶回收纯化试剂盒的说明进行回收。同时将PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

2.4 重组原核表达质粒的构建 用限制性内切酶Bam HⅠ和 H in dⅢ对 PCR产物和p ET28a(+)进行双酶切,反应温度均为37℃,2 h。酶切完毕后,将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,然后回收酶切片断,将目的片断M b2277和载体p ET28a(+)进行连接,16℃连接过夜,构建重组质粒。将上述重组质粒转化至 E.coli BL 21感受态细胞,加800μL LB培养基,摇床上温育1 h,将已转化的细胞转移到Kan-LB平板培养基上,37℃培养过夜。调取克隆接种至含有100μg/m L Kan-LB液体培养基中,振荡培养10 h,按试剂盒说明提取重组质粒进行酶切鉴定,阳性者送至上海捷瑞生物技术有限公司进行测序。

2.5 M b2277基因的诱导表达 将测序证实的单菌落接入2m L kan-LB(Kan终浓度为50μg/mL)培养基中,37℃振摇培养过夜。离心收集细胞,将细胞重悬于2mL kan-LB中,以此接种入50m L培养基,37℃摇床培养至 OD600nm值至 0.6;将培养物分成2份,其中一份加入 IPTG至终浓度1 mmol/L,另一份不加IPTG作为对照,继续培养。分别于诱导0、2、4、6、8、10 h各取1m L 菌液 ,1 2000 r/min离心10 m in,弃上清,后分别加入100μL 1×上样缓冲液,重悬菌体后于99℃煮沸10 min,离心5 min后进行SDS-PA GE分析。

2.6 蛋白质印迹分析 表达产物经12%SDSPAGE分析后,按文献〔6〕所述方法,以B IO-RAD 系统电转至PVDF膜上进行免疫染色,经小牛血清白蛋白封闭后,依次加入牛分枝杆菌分泌上清免疫家兔获得的阳性血清的稀释液(1∶100),辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的抗体的稀释液(1∶1 000),最后X放射自显影。

3 结 果

3.1 MB2277基因扩增 以牛分枝杆菌基因组DNA为模板,用合成的引物进行 PCR扩增,经1%琼脂糖凝胶电泳分析,可见504bp的DNA片段(图略),与实验预期的M b2277 DNA片段大小相一致。

3.2 重组质粒的构建和序列分析 PCR产物与p ET28a(+)连接,构建重组质粒。经B am HⅠ和H in dⅢ双酶切后,可见质粒片断和504 bp的插入片段(图略)。序列分析证实,该DNA片断大小为504 bp,与 GenBank中登陆的牛分枝杆菌AF2122/97的 M b2277基因序列一致,同源性为99%。

3.3 原核表达质粒的构建和酶切鉴定 重组质粒经双酶切,转化至BL 21,通过双酶切得到质粒片断和504bp的插入片段,成功构建出原核表达质粒。

3.4 M b2277基因的诱导表达 经 IPTG诱导的重组质粒在 E.coli BL 21中,在分子量约为25 ku处有明显条带,与预测的融合蛋白分子量一致,在诱导6 h出现了最大表达量(图略)。

3.5 蛋白质印迹分析 从图中可见25ku处有一条明显的蛋白印迹带,由此说明该表达产物具有牛分枝杆菌抗原性(图2)。

4 讨 论

本研究以牛分枝杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增,经克隆、序列分析和双酶切鉴定,获得了M.bovis分泌蛋白M b2277原核表达菌株,IPTG诱导表达,实现了M b2277蛋白在体外安全、高效的表达。利用牛分枝杆菌阳性血清对其进行Western blotting检测,结果表明牛分枝杆菌M b2277蛋白具有较强的免疫原性。

我们也曾用结核病人的血清进行 Western blotting,在25ku处也出现阳性条带,进一步证明了M b2277蛋白较强的免疫原性,提示其也具有用于人结核的检测的可能性。关于牛分枝杆菌M b2277蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究国内尚未见到报道。因此,本研究为进一步研究牛分枝杆菌M b2277基因工程亚单位疫苗及核酸疫苗奠定了基础。

〔1〕刘思国,于辉,宫强,等.牛结核病研究进展〔J〕.畜牧兽医科技信息,2003,10:10-14.

〔2〕John BK,CharlesO T Tuberculosis〔J〕.Zoonosis Update,2004,224:685-691.

〔3〕Andersen PD,Askgaard,Gottschau A,et al,Identification of immunodominan antigens during infection with Mycobacterium tuberculosis〔J〕.Scand J Immunol,1992,36:823-831.

〔4〕Ida Rosenkrands,Karin Weldingh,Susanne Jacobsen,et al.M apping and identification of Mycobacterium tuberculosis proteins by two-dimensional gelelectro phoresis,microsequencing and immuno detection〔J〕.Electrophoresis,2000,21:935-948.

〔5〕Ida Rosenkrands,Angus King,Karin Weldingh,et al.Towards the p roteome of M ycobacterium tuberculosis〔J〕.Electrophoresis,2000,21,3740-3756.

〔6〕萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南〔M〕.3版.北京:科学出版社,2002:886-898.

Expression of M b2277 of M.bovis and in itial research on its reactogen icity

L IU Fang,ZHU Jian-guo,HUA Xiu-guo,GAO QianAN Yi-jia

(Shanghai Jiaotong University College of A griculture and Biological,Shanghai 200240,China)

To obtain fusion protein of Mycobacterium bovis with high purity,the recombinant p rokaryotic expression vector for M b2277 gene was constructed and the immunogenicity of its products was initially investigated in the p resent study.A pair of p rimer was designed acco rding the gene sequence M b2277 from the genomic DNA of M.Bovis in GenBank.and was amp lified by PCR using DNA of M.Bovi s 93006 strain as temp late.The PCR product and p ET-28a(+)was then digested by Bam HⅠand EcoRⅠdouble enzyme.To constructed a p rokaryotic expression plasmid,the purified M b2277 was cloned to p ET28a(+).Then the recombinant plasmid was transformed into competent cell of E.coli BL 21(DE3).The bacteria were induced by IPTGand its lysates were analyzed by SDS-PAGEand Western-blotting.In this way,the prokaryotic expression plasmid for M.bovis M b 2277 protin was obtained,and a expression band with molecular of 25 ku could be found in SDS-PAGE analysis.As demonstrated by Western blotting this expression product showed excellent reactivity with rabbit immune sera against M.bovis.

M ycobacterium bovis;secretion proteinum;M b2277

R378

A

1002-2694(2010)01-0033-03

＊上海市自然科学基金项目(04ZR14089)及上海市西部合作项目(055458023)

朱建国,Email:zhu_jg@sjtu.edu.cn

1.上海交通大学农业与生物学院,上海 200240;

2.复旦大学公共卫生学院,上海 200032

2009-05-26;

2009-10-15