脊柱融合的实验研究进展

剧荣森，郭昭庆

（1.北京市中关村医院骨科，北京 100190；2.北京大学第三医院 骨科，北京 100191）

脊柱融合（spinal fusion）手术于 1911年由Albee和Hibbs首次报道，目前已经成为脊柱外科手术治疗的一种常用方法。由于脊柱融合是一个多因素的复杂过程，临床缺少可靠的非损伤性技术对融合的成功与否进行评价，因此很难研究单个因素对脊柱融合的影响。1913年Albee首次使用动物模型进行脊柱融合研究。近些年来，随着骨组织工程和基因治疗的兴起以及微创技术的使用，脊柱融合的实验研究得到了快速的发展。下面就脊柱融合的实验研究做一综述。

1 脊柱融合的实验动物的选择

脊柱融合的动物模型根据研究的内容不同，主要分为两类：生物力学模型和生物学模型。生物力学模型是研究脊柱的生物力学情况或脊柱器械的应用情况，选择较大的动物模型比较适合，例如犬、羊、猴等，因为脊柱的大小和骨性解剖与人类的脊柱比较接近，获得的数据更可靠和实用；而生物学模型是研究脊柱融合的生物愈合过程和愈合机制，利用小的动物模型（例如鼠）可以获得大量的数据，比利用大的动物模型获得少量的数据要有价值。

1.1 鼠

鼠作为脊柱融合的实验动物开始应用于评价药物对脊柱融合的整体作用，近年来主要用于在组织工程和基因治疗在脊柱融合的研究。由于裸鼠无免疫原性，在组织工程骨的研究中更为常用。Radall［1］用腺病毒（adenovir）作载体体外转染携带骨形态发生蛋白-9（rhBMP-9）的骨髓基质干细胞（hMSC），然后注射到裸鼠椎旁肌，8周后可见脊柱融合。Alden等［2］将含有骨形态发生蛋白2的腺病毒经皮直接注入裸鼠的腰椎间隙，12周后CT扫描和组织学检查发现在所有注入部位均有新骨形成，椎体被融合在一起。

1.2 兔

兔是腰椎解剖与人类相似的最小动物之一，其骨性解剖部位可以提供足够的空间进行移植物植入，同时能够提供足够的髂骨进行自体骨移植对照，而且兔的融合率与人相似，可以有效地比较不同诱导材料的成骨活性，而且，兔的开放性很强，便于饲养和维护，有很高的成本效应比。多用于单节段胸腰椎融合，多采用横突间融合模式，Boden等［3］用浸有骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）的胶原海绵放置在新西兰大白兔的去皮质后的L4-L5横突间隙，10周后可见坚固的横突间融合。Feiertag MA等［4］用42只新西兰大白兔实施自体髂骨块移植横突间融合，实验组术后使之积极活动，对照组术后不人为干扰其活动，结果实验组融合率只有13％，而对照组融合率有50％，二者差异有显著性。

1.3 犬

犬模型被用来详细研究骨移植替代物，骨生长因子。研究人员已经研究出多种不同犬的融合模式，其中包括腰椎和胸椎后横突间融合与前椎间融合。David SM等［5］用成年比格犬行双侧L4-5横突间融合比较了rhBMP-2结合I型胶原和聚乳酸做载体对脊柱融合的效果，结果显示rhBMP-2结合I型胶原可产生100％融合率且无不良反应。Meyer［6］应用犬对BMP-2因子的安全性进行了有益的探讨，20只成熟猎犬均行L5双侧椎板切除术，并刺破硬膜，使脑脊液外漏 实验动物随机分为两组，分别植入自体骨及复合rhBMP-2的骨移植材料，研究者发现：BMP-2组可以促进椎板切除处骨愈合，并且在鞘膜囊及脊髓处无异常矿化。

1.4 羊

包括绵羊和山羊。绵羊模型用于前路的颈椎和腰椎融合、侧后方腰椎融合，椎间孔椎间融合（TLIF ）和内窥镜胸腰椎融合。Kandziora等［7］使用绵羊颈前路减压融合模型比较了不同的生长因子对脊柱融合术的影响，结果显示胰岛素样生长因子（IGF）-1/转化生长因子（TGF）-1和重组人骨形态发生蛋白（骨形态发生蛋白）-2都显著增加脊柱融和的生物力学稳定性。山羊是颈椎前路椎间融合研究中最理想的实验动物。山羊具有头部直立、颈椎垂直负重等特点，脊柱融合的生物力学环境与人体相似，而且山羊的椎间盘和椎体的大小也与人类似，能够有效地比较植入物在人体的情况，Zdeblick等［8］多次成功的用山羊模型做了颈椎前路椎间盘切除融合的实验。

1.5 猪

猪已被用于颈椎，胸椎和腰椎融合模型。最常用于前路脊柱融合。1994年，Rubino等［9］开发了一种内镜下前路颈椎和上胸椎的手术模式。证明在内镜帮助下，可以清晰地暴露显示C1-T3的椎间盘，所有的猪都能很好的耐受手术，术后验尸报告显示手术部位准确、减压效果确切。Li等［10］设计了一个实验，以评估椎间盘组织对椎间融合的影响。用猪行前路腰椎间融合，实验组完全去除椎间盘组织，使用椎间融合器与自体髂骨作椎间融合，对照组仅用自体髂骨作椎间融合而保留部分自体髓核。结果实验组取得70％的融合，而对照组的融合率只有10％。从而表明椎间盘切除对椎间融合是必要的。

1.6 猴（非人类灵长类动物）

非人类灵长类动物是和人类表型最相似的动物，分享98％的遗传同质性。灵长类动物脊柱解剖于人类非常相近，尤其是在腰椎。最常见的实验用灵长类动物是猕猴和恒河猴。由于猴比较珍贵，往往是用于新型脊柱融合技术、生长因子、以及其他骨移植的替代品临床前的终末期研究。Hecht等［11］用圆柱形同种异体皮质骨块和浸有rhBMP的胶原海绵在猕猴身上行L7-S1前路椎体间植骨融合，8周后融合率100％ 。Boden等［12］用21只恒河猴做双侧腰椎横突间融合实验，其中16只用后路开放性手术，5只用借助内窥镜的侧后方入路微创手术，用羟基磷灰石-磷酸三钙（HA-TCP）与rhBMP-2做植入物，结果表明羟基磷灰石-磷酸三钙（HA-TCP）与rhBMP-2做植入物融合率100％，而两种手术方式融合效果无差别。

2 脊柱融合动物实验的手术方法

根据手术创伤的大小，可分为两类：开放性手术和微创性手术。根据融合部位不同可分为：经前方椎体间融合；经后方椎体间融合、棘突间融合；后外侧横突间、椎板间融合、关节突间融合。不同的手术方法应用于不同的实验目的。不同类型的融合技术由于局部解剖结构和血液供应的差异，愈合的过程和愈合的结果存在很大差异。椎体间脊柱融合能提供相对较大的移植空间，移植物血液供应丰富，移植物同时受到较大的机械应力负重，而横突间脊柱融合提供的空间相对较小，去皮质后对移植物的血液供应比椎体间相对少，特别是在移植物的中央部位没有直接的血液供应，需要血管再生化。研究中最常用的脊柱融合技术是前方椎体间融合和后外侧横突间融合。最常用的脊柱节段是颈椎和腰椎。颈椎多采用椎体间融合技术；腰椎节段采用椎体间和横突间两种脊柱融合技术。选用胸椎节段脊柱融合，可以利用胸椎节段内在的稳定性，避免脊柱不稳定对融合产生影响［13］。

开放性手术可满足所有的融合部位的需要。但传统开放性手术有三大主要缺陷：肌肉去血供和去神经化，供区并发症和假关节形成。而微创手术可以减少或消除这些弊端。微创手术可分为经皮穿刺和小切口手术，后者常借助腹腔镜或内窥镜的帮助。经皮穿刺手术一般用在鼠，用以研究骨生长因子对脊柱融合的促进作用。A lden TD等［14］用腺病毒作载体体外转染骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2），然后经皮注射到裸鼠腰骶肌旁，证明基因治疗对脊柱融合是有用的。微创手术在报道中常借助内窥镜，应用于前路椎间融合和后外侧横突间融合。Boden等［3］在用兔和猴研究浸有骨形态发生蛋白-2 （rhBMP-2）的胶原海绵促进横突间融合实验中，通过对比得出了借助内窥镜的微创手术和开放性手术对横突间融合有一样的效果。具体微创手术过程如下：在L4-L5水平中线两侧各开一个1.5～2.0 cm的切口，借助一个带有30度镜头的光纤导管，在显示器监视下用一弯曲的微型扩张器通过多裂肌和最长肌间隙进入暴露横突，通过中空管鞘置入一枚直径5 mm的钻头，对局部横突去皮质，再通过一中空工作管置入浸有骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）的胶原海绵微块，可吸收缝线缝合穿刺切口。Riley等［15］用小型猪对比了借助腹腔镜微创与开放性手术行前路L7-S1单节段椎体融合的效果，结果显示虽然借助腹腔镜前路可以完成腰骶椎融合，但其术后融合骨块的生物力学尚没有达到开放性手术融合的效果。其微创具体过程如下：往腹腔打入15 mmHg气压造成气腹，在腹腔建立标准的五个入口，通过不同的入口分别用18号穿刺针经皮穿刺导出膀胱内尿液，用一枚腹腔钉和腹腔钳将排空的膀胱推至右侧腹壁外，远离腰骶联合处；牵开血管；充分暴露腰骶联合处，通过腹腔镜配套的刮匙、骨凿、咬骨钳去除椎间盘，高速磨钻使上下终板去皮质化，最后放入植入物。笔者尚未查到后外侧入路行腰椎体间融合的微创动物实验，但在动物身上进行的PLDD（经皮椎间盘激光减压术）的手术入路可资借鉴：游箭等［16］用犬进行L3～4、L4～5、L5～6三节段的PLDD，入路如下：犬取右侧卧位，在透视下选定进针平面，采用左侧距正中线5～7cm作为穿刺点，透视监视下穿刺椎间盘，透视正侧位对比，正位针尖达棘突水平，侧位针体平行于椎体上下缘，针尖达中后/3水平，临床上郭江等［17］介绍了一种经皮穿刺放置可膨胀式椎间融合器行椎间融合的新技术，其手术入路同PLDD及髓核切吸术相同：从L4-5间隙水平中线旁开8 cm作为穿刺点，通过腰大肌旁肌间隙向L4-5椎间盘进针，逐层上套管，固定 6 mm工作套管于纤维环内，经此通路，钳取和吸出椎间隙髓核组织；用长柄中空方形括匙刮除软骨终板及部分骨性终板，直到上下椎体表面出血。随即将 4 g异体骨块，用植骨器压入椎间隙内，再将带安装手柄的内固定，由以色列Disc2O2Tech公司生产的 B2TW IN器械送入椎间隙内，旋转安装手柄逐段膨胀，取出安装手柄。

3 脊柱融合的移植物的选择

在脊柱融合的实验研究中，多种材料曾被应用。可分为两类：天然骨和人工骨。

3.1 天然骨

天然骨移植物包括自体骨和异体骨，异体骨又有同种异体骨和异种骨之分。自体骨移植因为同时具有骨诱导、骨传导、骨形成作用，融合率高且无免疫反应一直被视为脊柱融合移植物的“金标准”，但自体骨移植存在很多问题。最大的问题是供骨区的并发症，如感染、骨折等，此外，临床上有一些病人无法取到足够的自体骨，如骨代谢、骨肿瘤病人。异体骨移植虽可以避免取自体骨所造成的并发症，骨量也可以得到满足，但异体骨最大的问题是骨生长能力低，被吸收率高，血管化程度低，导致融合率低，此外，异体骨还有传染疾病，引起宿主炎性或免疫排斥反应的危险。以上种种限制了天然骨作为脊柱融合移植物的应用。

3.2 人工骨

也称组织工程骨。包括3个基本要素：（1）种子细胞（2）诱导成骨因子（3）合适的生物材料支架载体。

3.2.1 种子细胞：具有成骨潜能的细胞都可以用来做种子细胞，包括骨髓基质细胞、成骨细胞、成纤维细胞、肌原细胞等。其中骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）应用最多，它可向骨细胞、软骨细胞分化，并能经体外培养大量扩增，有望成为骨组织工程最为理想的种子细胞。体外分离培养多取自实验动物如大鼠断开的股骨以DMEM培养基冲出骨髓，制成细胞悬液，离心、洗涤后，加入胎牛血清培养，胰蛋白酶消化传代使用。

3.2.2 诱导成骨因子：Urist［18］在1965年的研究中显示了脱钙骨基质中的某种物质具有骨诱导能力，后来这种蛋白物质被提纯命名为骨形态发生蛋白（bonemorphogenetic proteins，BMPS），以后人们又陆续发现了很多具有诱导骨生成的因子，包括LIM矿化蛋白（LIM m ineralization protein，LMP）、成纤维细胞生长因子-2（fibroblast grow th factor-2，FGF-2）、胰岛素样生长因子 （insulinlike growth factor，IGF）、生长分化因子-5（growth and differentiation factor-5，GDF-5）、血管内皮生长因子等。研究应用最多的还是BMP。目前，BMP家族现已分离纯化了 20种蛋白，其中最重要的是BMP-2。BMP-2具有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力，同时具有使成骨细胞的前体细胞定向分化为成骨细胞的能力。BMP诱导成骨需3个条件：①达到有效BMP浓度，②存在BMP的靶细胞群：体内骨髓中诱导性成骨细胞、结缔组织中未分化、有活力的间充质细胞、成纤维细胞、骨膜细胞等，③允许骨生长的正常环境。Schimandle［19］首次将rhBMP-2用于后外侧横突间脊柱融合动物模型中，所有rhBMP-2组达到100％坚强脊柱融合，生物力学检测rhBMP-2组强度和硬度均超过自体骨组。BMP在不同部位的异位诱骨能力是不同的。Okubo［20］将5 lg rhBMP复合胶原后植入大鼠体内不同部位，测试hBMP在体内不同部位的异位诱骨能力，测试部位包括肌肉内、肌间、皮下和脂肪，结果发现在所有部位都有异位骨生成，而植

入肌肉内的诱骨情况最好，脂肪内的情况最差。最近的实验表明联合两种BMP单体比比单独使用一种单体更有诱导活性。研发现 rhBMP-2/rhBMP-7、rhBMP-4/rhBMP-2骨诱导活性是rhBM2活性的5～10倍［21］。BMP极易在局部组织中迅速降解或随体液扩散流失，单独应用达不到诱发骨生长的目的，复合生物载体可减缓它的释放，增加它的效果。

3.2.3 合适的生物材料支架载体：生物载体应发挥的作用包括：提供骨细胞生长的支架，诱导骨生长，减缓骨诱导因子的释放。理想的载体材料应当具有以下特点：①生物相容性较好。②无细胞毒性。③无抗原性或抗原性较低。④生物降解与新骨形成同时进行，对新骨形成无影响。⑤尤其负重部位骨缺损要求移植物有一定机械强度。⑥易消毒和贮藏。组织工程骨载体按形态和用法可分为两大类：固态和液态。固态载体无法注射应用，而液态载体可注射使用。

3.2.3.1 固态型（不可注射）载体：包括磷陶瓷（calcium phosphate ceramics，CPC）、脱蛋白骨 AOB、多乳酸多羟基乙酰共聚物（PLA/PGA）、不溶性非胶原蛋白（iNCP）、骨基质明胶（BM）、聚乳酸（PLA）等，近年来钙磷陶瓷由于有良好的骨传导性研究越来越多。CPC主要包括三种形式：羟基磷灰石（hydroxyapatite）、磷酸三钙（tricalcium phosphate）和碳酸钙（calcium carbonate）。三种形式各有特点：羟基磷灰石化学成分类似于骨的矿化基质成分，具有很好的生物相容性，没有系统毒性，没有炎性或异物反应。羟基磷灰石移植到体内骨性环境中能够与宿主骨产生紧密的结合［22］。但羟基磷灰石有其致命的缺点：脆、张力低、不能生物降解；磷酸三钙有良好的生物降解性；而碳酸钙吸收率最高。为了充分利用各种材料的优点，新兴复合载体的研究越来越受重视。马兴，胡蕴玉等［23］使用颗粒型聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙［PLGA/TCP］与牛bBMP复合成人工骨进行兔椎板间多节段脊柱融合，结果显示仿生活性人工骨诱导兔椎板间多节段的脊柱融合获得成功，其融合率明显高于自体髂骨移植。张余、尹庆水等［24］用复合珊瑚羟基磷灰石人工骨用犬做颈椎椎间融合，结果人工骨比自体骨的融合效果好。

3.2.3.2 液态型（可注射型）载体：可注射型载体可以采用局部注射的方式应用，从而避免手术创伤及手术并发症，具有广阔的应用前景。如、纤维蛋白粘合剂（FS）、胶原（collagen）、藻酸盐（alginates）、角鲨烷（squalane）聚乙烯吡咯烷酮（PV P）以及可注射性磷酸钙、硫酸钙、藻酸钙骨水泥等。纤维蛋白是血液在正常状态下凝固的终产物。其单体在凝血酶作用下聚合成具有可塑形性、可黏附性、可降解性及生物相容性的立体网状结构，还可调节从液态转变为凝胶的时间［25］。胶原为纤维的组成部分，是细胞外基质 ECM的重要成分，可用做骨软骨细胞的培养基质。胶原具有适宜的微孔径、较好的渗透性，适于营养物质、生物因子扩散及血管长入。藻酸盐是一类从褐藻中提取的天然化合物，作为载体，有很好的优越性：承载细胞量大，细胞接近体内的生活状态，可进行营养和代谢物质的交换，有利于细胞基质的分泌和浓度的保持。目前，可注射型载体在骨修复的实验研究较多，而在脊柱融合方面的实验鲜有报道。刘通方、刘建等［26］在小鼠肌袋用注射型磷酸钙骨水泥 /纤维蛋白胶复合BMP，结果证明在充分发挥纤维蛋白对 BMP缓释作用的同时又使载体获得了良好的机械性能。李民、周跃等［27］应用可注射硫酸钙按1∶1混合自体松质骨粒为植入物在狗行前路L3/4、L5/6椎间融合，比较自体髂骨块为植入物的椎间融合，在术后 12周时，椎间隙基本融合，与自体髂骨融合相似。

建造组织工程骨的方式有以下三种［28］：①支架材料与成骨细胞；②支架材料与生长因子；③支架材料与成骨细胞与生长因子。用新型支架材料与生长因子复合做人工骨移植似乎是脊柱融合实验的热门［23-25，27］。

4 脊柱融合实验的新领域——基因治疗

随着分子生物学和基因组学的快速发展，可以预见基因治疗将成为未来的发展方向。基因治疗方法包括基因转移 （gene transfer）和基因转染（gene transfection）。基因转移也称为体内转移，即 in vivo方法，是将带有目的基因的载体直接注入体内。基因转染也称为体外转移，即ex vivo方法，是体外细胞培养，转染目的基因后再注入体内。脊柱融合实验包装基因的载体是基因治疗必不可少的部份，目前，基因转染载体分为两大类：非病毒载体和病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、基因枪和裸露的DNA。目前大多数高效载体是病毒载体，包括反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和慢病毒、其中以前二种载体较常用。Alden等［2］将含有骨形态发生蛋白2的腺病毒经皮直接注入裸鼠的腰椎间隙，12周后CT扫描和组织学检查发现在所有注入部位均有新骨形成，椎体被融合在一起。Radall等［1］用腺病毒作载体体外转染携带骨形态发生蛋白-9（rhBMP-9）的骨髓基质干细胞（hMSC），然后注射到裸鼠椎旁肌旁，8周后可见脊柱融合。

虽然脊柱融合的基因治疗取得了大量的成果，但不能否认的是基因治疗尚处于起始阶段，基因治疗中存在的不可控性和基因突变等问题尚需要长时间的观察。所以，要将基因治疗用于临床脊柱融合修复还需要更深入的研究。

5 脊柱融合实验的评价方法

一种新的脊柱融合技术或移植物能否达到确切的脊柱融合要求，要有客观的评价方法。目前世界上公认的评价方法有以下几种：（1）生物力学检查：包括融合骨块的目测法，双盲的触诊法，力学测试仪测试：包括压缩、牵拉、弯曲和扭曲力学测试；（2）影像学检查：包括对融合动物局部的普通X-RAY摄像、CT摄像检查观察对比脊柱融合情况；（3）组织学检查。另外，扫描电镜和透射电镜检查、骨密度测试以及三维微CT检查也被用到［29］。

脊柱融合从报道到现在已将近100年，要减少组织损伤所带来的并发症，微创手术是发展方向；椎间融合因为植骨面积大、融合率高、对脊柱生理曲度的矫正效果好仍是首选的手术方式；脊柱融合骨移植物的选择方面，新型可注射型生物载体复合BMP的人工骨是趋势。如何用最小的创伤、最少的手术并发症的方法来达到最有效的脊柱融合效果从而造福人类是脊柱融合实验根本的出发点。

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