B细胞耐受原阿贝莫司钠的研究现状及启示

肖智勇，陈少辉，周文霞，张永祥

(军事医学科学院毒物药物研究所中药和神经免疫药理学研究室，北京 100850)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种慢性自身免疫性结缔组织病，由于体内有大量致病性自身抗体和免疫复合物，造成组织损伤，临床可以出现多个系统和脏器损害的症状，以肾脏损害最为常见。约50%的红斑狼疮患者并发狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)，严重者将导致肾衰竭，目前尚无法根治。多年来沿用的SLE治疗药物，如糖皮质激素和硫唑嘌呤、细胞毒性药物环磷酰胺等虽能在一定程度上缓解病情，但对机体免疫系统作用缺乏选择性，不良反应严重，不宜长期使用。因此，研发新型高效低毒治疗SLE的药物一直是免疫药理学研究的热点。近年来，虽有许多针对不同免疫治疗靶点的新药进行了临床试验，但至今无一获得成功［1－2］。由于SLE病因不明，病情相当复杂，给其治疗和新药研发带来极大的困难，近50年来美国FDA未批准治疗LN新药上市。2009年2月，美国La Jolla制药公司宣布，对研究了15年的抗SLE拳头化合物阿贝莫司钠(abetimus sodium，LJP-394)由于缺乏确切的疗效，停止进一步开发［3－4］。阿贝莫司钠退出临床研究对整个SLE新药研发都是一个不小的打击。本文拟对阿贝莫司钠的作用特点和研究脉络作一综述，为SLE的新药研发提供借鉴。

1 阿贝莫司钠的结构与功能

阿贝莫司钠是一种人工合成的能够诱导机体发生免疫耐受的分子，相对分子质量约为54 000，由4个20 bp双链寡核苷酸与1个三甘醇氨基甲酸酯骨架组成。从结构上分析，阿贝莫司钠中超过70%的成分为双链DNA(double stranded DNA，dsDNA)，因此，它只与能识别 dsDNA的靶蛋白，即抗dsDNA抗体结合。阿贝莫司钠即通过与B细胞表面抗dsDNA抗体交联而诱导B细胞对其产生免疫耐受［5］。

抗dsDNA抗体是SLE的标志性自身抗体之一，参与SLE的病理生理过程，引发器官损伤。DNA-DNA抗体复合物可原位形成或循环沉积于肾小球毛细血管基底膜，进而固定补体，引起肾脏损伤。还有一些抗dsDNA抗体可直接结合于肾小球膜的阴离子组分，如层黏附蛋白、肝素以及葡聚糖等，进一步引发肾脏损伤。SLE患者高滴度的抗dsDNA抗体水平常与其急性肾脏损伤，尤其是肾小球肾炎呈正相关［6］，抗dsDNA抗体水平升高是预测SLE病情恶化的最好指标［7］。此外，研究表明，抗dsDNA抗体水平与补体C3水平呈负相关，而补体C3水平降低与SLE病情严重程度呈正相关［8］。

阿贝莫司钠进入体内后可迅速降低循环抗dsDNA抗体水平，一方面阿贝莫司钠与抗dsDNA抗体结合，形成小分子可溶性复合物，该复合物不引起明显的补体活化;另一方面，阿贝莫司钠与B细胞结合，诱导B细胞凋亡，减少抗dsDNA抗体产生。不同患者抗dsDNA抗体与阿贝莫司钠的寡核苷酸表位结合的亲和力不同，亲和力高的患者给予阿贝莫司钠后抗dsDNA抗体下降更加明显［9］。阿贝莫司钠的药理学作用均与其直接或间接降低抗dsDNA抗体水平有关。除此之外，未发现阿贝莫司钠的其他药理活性。阿贝莫司钠无免疫原性或抗原性，不能激活自然杀伤细胞，对T细胞介导的迟发型超敏反应也无明显影响［6］。

2 阿贝莫司钠对狼疮模型动物的治疗作用

阿贝莫司钠在狼疮模型上的动物实验始于上世纪90年代初期。研究结果表明，无论是在免疫诱导还是在自发性狼疮小鼠模型上，阿贝莫司钠均能导致抗dsDNA抗体特异性B细胞出现免疫耐受。用 dsDNA-钥孔嘁血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)免疫模型小鼠研究结果表明，阿贝莫司钠能剂量依赖性地降低循环抗dsDNA抗体水平，最高可使其降低80%，但对小鼠抗KLH抗体水平并无影响。对于自发性狼疮的BXSB雄性小鼠，从2月龄开始给予阿贝莫司钠能显著降低其抗dsDNA抗体水平(＞60%)，减少脾脏抗dsDNA抗体产生细胞数目，改善狼疮小鼠尿蛋白并提高其存活率［10］。总的来说，阿贝莫司钠可以减少自身免疫性B细胞抗dsDNA抗体产生，这也与诱导免疫耐受可减轻病理性自身抗体致病作用的理论假设相一致。

3 阿贝莫司钠的临床试验结果

阿贝莫司钠的临床试验始于1994年，截至于2009年，有1000多例患者参加。与目前临床广泛应用的免疫抑制剂比较，阿贝莫司钠的最大优势在于无明显的毒性作用。

3.1 药代动力学［6］

阿贝莫司钠降低抗dsDNA抗体水平的效应可持续到其从循环中被消除。Ⅱ期临床试验(LJP-394-90-06，LJP-394-90-13)表明，SLE患者iv给予阿贝莫司钠100 mg后，其清除半衰期约1 h。阿贝莫司钠的分布体积较低，表明它主要分布于循环系统，较少进入组织器官。由于阿贝莫司钠的高清除率和每周1次的静脉给药方式，大部分患者在下次给药时在血浆中已基本检测不到阿贝莫司钠。阿贝莫司钠降低抗dsDNA抗体水平和其稳态血浆水平之间缺乏相关性，因而限制了使用药代动力学模型来推算阿贝莫司钠的合适使用剂量。阿贝莫司钠的给药频率为每周1次，超过1次的效应未进行研究。但是，每周给药不足1次会影响其降低抗dsDNA抗体水平的效应。停药后，患者抗dsDNA抗体恢复至治疗前水平至少需要2个月以上。

3.2 药物相互作用［11］

在人、恒河猴、大鼠和小鼠的肝脏及肾脏微粒体中，未观察到阿贝莫司钠发生降解，表明阿贝莫司钠不会在肝及肾脏的微粒体组分中进行代谢。因此，阿贝莫司钠的效应主要源于其诱导B细胞发生免疫耐受，继而降低抗dsDNA抗体水平。

3.3 治疗效果［12］

阿贝莫司钠已完成的Ⅲ期临床试验主要有LJP-394-90-05和LJP-394-90-09，试验的目的主要是观察有肾炎病史的SLE患者给药后能否降低肾炎复发的频率或延缓肾炎复发的时间。第二终点(secondary end points)是发生SLE复发以及需要使用高剂量皮质激素和(或)环磷酰胺(high-dose corticosteroids and/or cyclophosphamide，HDCC)治疗。患者入选标准是:①根据美国风湿病学会诊断标准诊断为SLE;②试验前4年内发生过LN，经环磷酰胺治疗或使用泼尼松≥30 mg·d－1，有实验室检验报告，或肾活检为Ⅲ，Ⅳ或Ⅴ型LN;③Farr测定法抗dsDNA抗体滴度≥15 kU·L－1。淘汰标准是:①3个月以内有肾炎发作;②3个月以内使用泼尼松 ＞20 mg·d－1，硫唑嘌呤 ＞200 mg·d－1，或每周甲氨蝶呤＞25 mg，以及任意剂量的环磷酰胺;③血清肌酐水平＞250 mg·L－1。SLE活性通过 SLE疾病活动指数(SLE disease activity index，SLEDAI)进行评价。

在LJP-394-90-05试验中，阿贝莫司钠治疗分为诱导期(4个月，每周100 mg)和维持期(15个月，每周50 mg)两个阶段。在维持期采用停药8周，给药12周，如此反复3次的给药方式。而在 LJP-394-90-09试验中，患者治疗周期为≤22个月，阿贝莫司钠剂量为每周100 mg。

3.3.1 肾炎复发

在LJP-394-90-05试验中，意向性治疗(intent-to-treat)患者中诱导期安慰剂组有9例出现肾炎复发，而在阿贝莫司钠治疗组仅有4例;维持期安慰剂组有14例出现肾炎复发，而阿贝莫司钠治疗组此时亦出现15例复发病例。抗体高亲和力患者中，诱导期安慰剂组有8例出现肾炎复发，而在阿贝莫司钠治疗组仅有1例;维持期安慰剂组有13例出现肾炎复发，而阿贝莫司钠治疗组仅出现6例复发病例［13］。比较LJP-394-90-05试验中诱导期和维持期的治疗效果可以看出，阿贝莫司钠在诱导期每周100 mg时的治疗效果优于维持期，说明给药剂量是影响药效的重要因素。根据以上结果，LJP-394-90-09试验采用了全程每周100 mg的给药方式。在LJP-394-90-09试验中，46周时，安慰剂组22例患者出现肾炎复发，阿贝莫司钠治疗组10例患者出现复发。试验结束时，安慰剂组24例患者出现复发，阿贝莫司钠组17例患者复发［14］。

LJP-394-90-05试验结果表明，安慰剂组的预计肾炎复发的中位时间为51个月，而阿贝莫司钠治疗组为158个月。LJP-394-90-09试验结果表明，安慰剂组的预计肾炎复发的中位时间为89个月，而阿贝莫司钠治疗组为123个月，两者无明显的统计学差异［14］。但是回顾性研究发现，在LJP-394-90-05试验中，抗体高亲和力的患者，阿贝莫司钠可延缓肾炎复发。

3.3.2 SLE 大复发

LJP-394-90-05试验中预计的安慰剂组SLE大复发的中位时间为23个月，阿贝莫司钠组的大复发时间为46个月(P＜0.01)。与安慰剂组复发率(41/97，42%)比较，阿贝莫司钠组SLE复发率(22/92，24%)降低43%(P＜0.01)。

LJP-394-90-09试验中预计的安慰剂组SLE大复发的中位时间为42个月，阿贝莫司钠组为55个月(P＞0.05)。与安慰剂组(47/153，31%)比较，阿贝莫司钠组SLE复发率(35/145，24%)降低21%(P ＞0.05)。

3.3.3 抗dsDNA抗体水平

LJP-394-90-05和LJP-394-90-09试验中，阿贝莫司钠均能显著降低患者抗dsDNA抗体水平(P＜0.001)，尤其是吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)或硫唑嘌呤治疗患者联用阿贝莫司钠后抗dsDNA抗体水平降低更为明显。降低的抗dsDNA抗体水平能部分缓解患者的临床症状。Cox回归分析表明，抗dsDNA抗体水平与肾炎复发的风险呈现相关性。LJP-394-90-05试验中，抗dsDNA抗体水平下降50%，肾炎复发风险降低52%。LJP-394-90-09试验中，抗dsDNA抗体水平下降50%，肾炎复发风险降低53%。此外，在LJP-394-90-05和LJP-394-90-09试验中，抗dsDNA抗体水平与补体C3水平均呈负相关。

鉴于前期的临床试验结果不能完全明确阿贝莫司钠是否对LN患者具有保护作用，2004年，La Jolla制药公司向FDA申请进行全球性的随机、双盲和安慰剂对照的多中心的Ⅲ期临床试验。试验募集了943例有LN病史的SLE患者，是迄今为止规模最大的针对SLE的临床试验。试验的目的依然在于确定JLP-394是否能有效延缓既往有肾脏病史的SLE患者肾炎复发的时间。为了确保得到明晰的试验结果，试验在LJP-394-90-05和LJP-394-90-09的基础上进行了改进:①试验时间缩短为12个月，每周1次连续给药;②由于增加样本数目有利于得到统计学差异，试验募集了大量的SLE患者;而且阿贝莫司钠治疗患者例数为使用安慰剂患者的2倍;③由于以往的试验结果提示，增加阿贝莫司钠剂量能更有效地降低抗dsDNA抗体水平，并且高剂量的阿贝莫司钠不会带来明显的不良反应［15］，试验采用的阿贝莫司钠剂量为每周300 mg和900 mg;④由于使用免疫抑制剂可以减少肾炎复发，从而难以从中区分阿贝莫司钠的疗效，因此制订了更为严格的患者准入标准。3个月内使用过环磷酰胺、肿瘤坏死因子抑制剂或环孢素的患者不能入选;2个月内使用过吗替麦考酚酯＞1000 mg·d－1，硫唑嘌呤 ＞100 mg·d－1，每周甲氨蝶呤 ＞10 mg，来氟米特(leflunomide)＞10 mg·d－1的患者不能入选;6个月内使用过利妥昔的患者也不能入选。

2009年2月，La Jolla制药公司突然宣布终止试验，停止开发阿贝莫司钠，中期有效性分析表明继续进行试验无意义。分析其原因可能在于SLE是一个高度异质性的疾病，遗传性危险因子具有高度多样性。SLE患者的免疫异常往往是难以预测的，即使临床表现相似的患者其病理生理学过程也可能存在显著的差异，这些差异给临床试验的设计带来了诸多挑战。目前的临床试验往往在募集患者时无法区分他们的疾病特征，而在结果分析时采用共同的评价标准，这就违背了疾病异质性的规律，也难以真正反映出药物的治疗效果。

4 结语

在大规模的Ⅲ期临床试验之前，如果能增加Ⅱ期临床试验的监测，全面评价其疗效和可能发生的继发病变，针对个体免疫功能的细微波动提供更多的药物作用特性的数据，能为Ⅲ期临床试验患者的合理分组和用药剂量选择提供更多的参考，从而尽量避免经验用药的盲目性。如果能在前期试验中尽可能发现疾病或药物反应的生物标志物，更准确地判断机体的反应性，从而提高药物对适宜人群的覆盖范围。

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