活性氧对P-糖蛋白调节作用的研究进展

董宪喆，毕明刚

恶性肿瘤是人类死亡的重要原因之一，化疗是目前临床治疗恶性肿瘤的主要手段。而肿瘤的化疗被内源性或获得性多药耐药(multidrug resistance，MDR)所限制，其中P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的过表达及其对底物的外排作用是最主要也是最普遍的耐药机制。P-gp介导的多药耐药表型是以P-gp高表达，使药物外排增加，细胞内药物蓄积减少为特征的。许多体外多药耐药模型的建立就是采用抗癌药物反复处理培养的肿瘤细胞或化疗后复发的肿瘤的方法的。在逆转MDR表型的的策略中，化学逆转剂被普遍接受，其主要通过逆转剂与MDR转运蛋白结合，竞争性抑制多药耐药相关的转运蛋白对化疗药物的外排而逆转MDR［1］。另外下调MDR基因的表达，进而抑制其编码的P-gp的过表达也是一个有效的策略［2］。因此，这些逆转剂特异性较差，往往有不明确的严重的不良反应。所以，能直接抑制P-gp的表达，同时具有一定的抗肿瘤活性的逆转剂具有相当高的临床应用价值。

1 P-gp与多药耐药

P-gp是由多药耐药基因(MDR1)编码的分子量为170 ku的与肿瘤多药耐药有关的跨膜磷酸糖蛋白，又称P-170。其介导的MDR机制在目前关于MDR发生中研究的较为深入，目前临床上主要的MDR逆转剂也是以P-gp为靶点逆转MDR的［3］。P-gp最早在秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢中发现，属于转运蛋白ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)超家族，现已发现在人的多种正常组织中也广泛存在，是人体内有毒物质的清除者，能抵御外源性毒素对机体正常组织造成的损伤［4］。它在多种具有天然耐药性和获得性耐药表型的肿瘤细胞中过表达，多项研究显示其过表达是肿瘤化疗过程中产生MDR现象的主要原因［5］。

P-gp由1 280个氨基酸残基组成，有4个基本结构域，即两个疏水性的跨膜区(transmembrane domains，TMD)和两个亲水性的核苷酸结合区(nucleotide-binding domains，NBD)。分别具有结合并转运底物的功能和结合并水解ATP释放能量的功能［6］。P-gp在内质网上合成，最后定位于细胞膜。其在细胞膜外侧有3个N连接的糖基化位点，在高尔基体上进行糖基化修饰，但糖基化修饰不是P-gp转运底物的关键［7］，只有助于P-gp发挥其它的生理作用。目前关于P-gp的转运机制的研究结果尚不一致，主要有几种模型，包括孔模型、外转酶模型、疏水真空泵模型等，分别从不同角度论证了P-gp对底物转运的机制［8］。在这些模型中，P-gp是ATP依赖的疏水真空泵的观点被广泛接受。该假设认为底物与P-gp上相应的结合位点结合后，两个NBD分别与一个ATP结合，同时形成NBD二聚体;二聚体导致TMD构象的改变，结合位点转移至胞外，同时使得P-gp与底物的亲和力下降，底物脱离P-gp，在胞外释放出来。随后ATP水解使NBD二聚体分离，P-gp恢复原来的构象。在整个过程中，ATP的结合和水解起到了至关重要的作用，故而认为P-gp具有ATP酶的活性［9］。P-gp的底物分子量一般较大，多为脂溶性物质，易与P-gp结合，可被动扩散进入细胞［10］。目前已发现多种常用药物均为P-gp的底物，如紫杉醇、长春新碱、秋水仙碱、替尼泊苷、阿霉素、依托泊苷、利多卡因等。所以，寻找P-gp的抑制剂势在必行。

2 ROS的生理作用及其诱导剂

ROS是呼吸链底物端和氧端漏出的电子没有参加ATP合成，而在线粒体内被氧化产生的活性氧自由基［11］。ROS是细胞内重要的信号分子，有研究显示［12］，纳摩尔水平的ROS是有利于细胞增殖的，而微摩尔水平的ROS则可以激活细胞内凋亡途径诱导细胞凋亡，毫摩尔水平的ROS可致细胞损伤坏死。ROS是线粒体去极化的重要介质，可以引起caspase-9活化，激活EPK1/2，激活线粒体凋亡途径;可以促进CD95 DISC的形成和caspase-8的活化，激活死亡受体途径;还可以刺激内质网Ca2+的释放，继而激活核酸内切酶，造成DNA损伤，或激活蛋白激酶C，引起原癌基因表达，即激活内质网途径，诱导细胞凋亡［13］。目前已经发现多种抗肿瘤药物或细胞毒药物，如砷剂［14］、非甾体抗炎药、调节Ca2+的药物、某些植物提取物、以及电离辐射、多柔比星等作为外源性的促凋亡信号，都是通过引起细胞内ROS水平的升高，破坏细胞内氧化还原的平衡而起到诱导细胞凋亡的作用的［15］。

3 ROS对P-gp的调节作用

3.1 过高浓度ROS对P-gp的调节 不同浓度的ROS在机体内的作用可能是截然相反的。有研究显示高浓度的ROS导致细胞的氧化应激反应会升高MDR1和MRP-1基因的表达。Christina等［16］将大鼠肝细胞用过氧化氢酶CAT抑制剂预处理1 h后再用过氧化氢处理，发现MDR1基因的mRNA和P-gp的表达均被上调，罗丹明123外排增加。而抗氧化剂(1 mmol·L－1维生素 C，10 mmol·L－1甘露醇，2% 二甲基亚砜，10 mmol·L－1N-乙酰半胱氨酸)则可以明显抑制MDR1基因mRNA和P-gp的过表达。进一步研究发现仅当过氧化氢的浓度超过500 μmol·L－1时P-gp的水平才被上调。此外，紫外照射、细胞外pH较低以及渗透压休克、热休克等应激反应都能诱导P-gp的表达，而这些应激因素都伴随着内源性的ROS的大量产生，其水平远远高于生理水平。

环氧化酶-2(Cox-2)是催化前列腺素合成第一步的酶，在大多数肿瘤中过表达，具有抗凋亡作用。Cox-2是ROS的来源，能导致内源性ROS的明显升高以及DNA单链断裂，而这种现象可以被Cox-2特异性抑制剂SC 58125明显抑制［17］。近来发现Cox-2对P-gp有一定的上调作用，而Cox-2抑制剂则可以抑制P-gp的表达。Vimal等［18］以腺病毒为载体把Cox-2 cDNA转染到大鼠肾小球细胞并采用基因芯片观察差异基因表达，发现在Cox-2过表达的细胞内MDR1基因表达明显升高，而MDR1基因表达的上调可以被Cox-2的特异性抑制剂NS398抑制。Zatelli等［19］也发现Cox-2抑制剂通过抑制P-gp的表达而抑制乳腺癌细胞的化疗耐药性。可见Cox-2对P-gp的表达有一定的调节作用，推测这是由于过量的Cox-2能明显升高细胞内的ROS水平，引发细胞的氧化应激，应激状态下的细胞为了避免受到过氧化损伤，使P-gp清除外源性有害物质的作用增强，表达升高。而Cox-2抑制剂则能降低细胞内的ROS水平，由此推测此时ROS的浓度应高于生理水平但低于应激水平，Cox-2抑制剂对P-gp的调节作用可能是通过调节细胞内ROS的含量而达到的。

有研究发现P-gp的过表达与抗凋亡的Bcl-xL蛋白水平相关，认为P-gp可能是通过调节caspase依赖的凋亡途径抑制凋亡的。另外，多项研究表明，缺氧的实体肿瘤易于产生化学耐药性，并且由此导致的预后不良更甚于供氧充足的肿瘤。故推测实体瘤中内源性P-gp的表达与肿瘤组织中心缺氧有关，又因为ROS作为细胞内重要的信号分子，在缺氧状态下水平明显升高，被认为是缺氧状态下最早的损伤信号［20］，推测ROS的过度升高造成的细胞氧化应激，继而上调P-gp的表达。ROS作为调节细胞增殖的信号因子时，其浓度在纳摩尔到微摩尔水平，此浓度远远低于造成DNA断裂所需要的浓度水平。而应激状态下的ROS水平明显高于生理条件下，已经达到毫摩尔水平，当过高浓度的ROS对细胞生存造成严重威胁时，P-gp的生理角色就转变成毒素清除者，旨在防止细胞凋亡。

3.2 高浓度ROS对P-gp的调节 ROS水平的过度升高可刺激细胞在氧化应激状态下进行自我保护，反而使得P-gp的表达升高。而在抗氧化剂或氧化剂抑制剂的适量存在下，则可以使得细胞内ROS水平适度高于生理水平，而降低P-gp的表达。

3.2.1 谷胱甘肽抑制剂对P-gp的调节 谷胱甘肽是机体内一种重要的抗氧化酶，它能够清除掉人体内的自由基，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被自由基等有害物质氧化，从而让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能。有研究显示［21］，细胞内谷胱甘肽的活性被谷胱甘肽抑制剂抑制后，内源性的多药耐药转运蛋白P-gp的表达同时被下调。丁胱亚磺酰亚胺(L-Buthionine Sulfoximine，BSO)是一种人工合成的氨基酸，可抑制γ-谷氨酰胺半胱氨酸合成酶的合成，降低细胞内谷胱甘肽的水平，已经成功应用于癌症患者的体内实验，并显示出使肿瘤细胞对抗癌药物增敏的效果［22］。Maria等采用BSO处理细胞抑制细胞内谷胱甘肽的合成，进而升高细胞内的ROS水平，发现在细胞内ROS升高的同时，P-gp的表达被下调。同时 p27Kip1、ERK1/2及JNK被激活。而BSO处理后的细胞内P-gp表达的下调可以被多种受体络氨酸激酶信号途径的阻断剂所终止［23］，如蛋白激酶C抑制剂BIM-1、Ro-31-8220、p21ras法尼基蛋白转化酶抑制剂Ⅲ、抑制ERK1/2活化的c-Raf抑制剂ZM336372和PD98059等。由此可见，ROS对P-gp的表达有一定的调节作用。而谷胱甘肽抑制剂通过升高细胞内ROS水平，可以下调细胞内P-gp的表达。其具体的作用机制可能是ROS作为第二信使参与酪氨酸激酶信号途径，通过激活该信号途径，使MAPK成员磷酸化，进而下调P-gp蛋白的表达。

3.2.2 糖酵解抑制剂对P-gp的调节 糖酵解途径是指细胞在细胞质中分解葡萄糖生成丙酮酸的过程，这一过程在细胞质中进行，不需要氧气，每一反应基本都由特异的酶催化，并伴有少量ATP的生成。Maria等［24］采用转染了P-gp-EGFP融合基因的前列腺癌细胞DU-145、神经胶质瘤细胞Gli36及人子宫颈癌细胞KB-3-1，这些细胞都有P-gp的高表达，使用碘醋酸酯(IA)或2-脱氧-D-葡萄糖(2-DDG)等糖酵解抑制剂抑制上述细胞糖酵解24 h后，发现细胞内ROS水平升高，同时P-gp表达下调，细胞对多柔比星的外排作用被明显减弱。而外源性自由基清除剂丙酮酸盐在降低ROS的产生的同时，P-gp的表达及细胞对底物多柔比星的外排作用均升高。由此可见P-gp的表达水平和肿瘤细胞糖酵解密切相关，可能是由于糖酵解抑制剂可以通过干扰细胞内的氧化还原状态，升高内源性ROS水平，进而下调P-gp的表达，抑制细胞对多柔比星的外排，也提示了糖酵解抑制剂在逆转P-gp介导的多药耐药表型方面的前景。

3.2.3 HIF-1α对P-gp的调节 缺氧诱导因子1α(hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α)是缺氧或某些氧化应激状态下产生的诱导低氧基因和修复细胞内环境的调节因子。低氧时HIF-1α表达增强，由此诱发的基因表达可以增加缺氧组织氧供或降低氧耗，使细胞内氧化还原状态保持平衡，在氧充足的条件下HIF-1α的亚基受到蛋白酶体的降解和遍在蛋白化作用的调节，而这种调节作用是依赖氧的存在的。研究显示［25］，P-gp在缺氧的条件下受 HIF-1α的调节。在 ROS生成酶Nox-1过表达的前列腺细胞DU-145Nox1及其亲代细胞DU-145中，多柔比星处理后的DU-145Nox1细胞内HIF-1α和P-gp水平均明显低于DU-145细胞，而ROS水平则明显高于亲代细胞DU-145，并且此时P-gp介导的MDR减弱。而用自由基清除剂维生素E和维生素C预处理的DU-145Nox1细胞中，HIF-1α和 P-gp水平均升高，但对 MDR1 mRNA的表达没有影响。可见HIF-1α和ROS在蛋白水平上对P-gp的表达存在一定的调节作用，ROS水平的升高可以减少P-gp的表达，抑制耐药细胞的MDR表型。但是ROS和HIF-1α何者为上游调控者还有待于进一步研究。

3.2.4 其他ROS诱导剂对P-gp的调节 其他ROS诱导剂也表现出对P-gp的调节作用。在低浓度的过氧化氢和表皮生长因子处理的细胞中P-gp的表达下调，且都能够适度升高细胞内的ROS水平，其程度不至于造成细胞的氧化应激，使细胞损伤性坏死，由此可以认为P-gp的表达受低浓度ROS的调节;在肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理过的细胞内P-gp表达下调，同时MDR表型被逆转［26］。而TNF-α是利用低浓度的ROS进行信号转导的，进一步说明 P-gp表达受低浓度的ROS的调节。Silvina等［27］研究发现，过表达的重亚基铁蛋白(heavy ferritin，H-FT)也能通过减轻细胞氧化应激反应，诱导P-gp的表达。H-FT转染的细胞MDR1 mRNA和P-gp表达增加，细胞表现出获得性MDR表型。H-FT有亚铁氧化酶活性，其水平的升高可以降低细胞内正常的ROS水平。由此可见，内源性ROS水平的适度升高可以防止MDR表型的产生。

4 ROS调节P-gp表达的可能机制

综上可见，ROS对P-gp确有调节作用，ROS水平的适度升高可以下调P-gp的表达，然而具体的机制目前还不确切。根据ROS的生理功能和P-gp的外排机制及其上游调控者的特点，推测有以下两种可能:①可能与ROS对线粒体能量代谢的调节有关。ROS产生于线粒体，同时对线粒体也有一定的调节作用，一旦ROS产生过多或细胞抗氧化能力下降，线粒体就会受到ROS的氧化攻击，造成线粒体电子传递链功能障碍、三羧酸循环障碍、ATP生成不足［28］，而ATP是细胞内蛋白合成修饰等酶促反应发生的基础。故ROS有可能通过影响线粒体内能量的生成进一步影响P-gp的合成，使P-gp的表达下调。② ROS作为第二信使直接参与调节P-gp的上游调控通路。MAPK家族成员如细胞外信号调节激酶(ERK)、JNK、MAPK等的激活可以下调mdr1基因的表达，而ROS处于MAPK的上游，可能通过调节这一通路进而调节mdr1基因的表达，间接下调P-gp的表达［29］。

5 目前针对P-gp的多药耐药逆转剂

以P-gp为靶点的MDR逆转剂的作用方式有几种，或与底物竞争性结合P-gp疏水区，或与细胞膜作用，修饰改变P-gp蛋白构象，或抑制P-gp与ATP的结合进而阻断外排泵能量来源，或与药物结合成复合物使药物不受P-gp识别，或直接下调P-gp的表达最终发挥抑制P-gp外排的作用［30］，目前发现的特异性高、不良反应小的逆转剂还很少。P-gp的抑制剂到目前已经发展了三代，维拉帕米作为第一代P-gp逆转剂的代表，是一种钙离子拮抗剂。它的感受器是P-gp本身，是竞争性抑制剂，所以其发挥作用需要很高的血药浓度，而高血药浓度暗示可能会有高的不良反应发生率，所以第一代逆转剂由于其非特异性而限制了应用。第二代逆转剂的代表右旋维拉帕米，虽P-gp的亲和力升高，但也由于较低的药理活性而无法用于临床。第三代逆转剂在活性和特异性方面都明显优于前两代逆转剂，能明显增加化疗药物在细胞内的浓度，但是在提高癌症患者的长期存活率方面并无显效［31］。通过改变化疗药物剂型使之避免被P-gp识别并排出细胞外也是逆转剂的一个研究方向，目前还在研究当中。

6 ROS诱导剂成为P-gp调节剂的可能性

好的MDR逆转剂首先应该具有一定的抗肿瘤活性，在对正常细胞没有明显不良影响的情况下，通过直接下调P-gp蛋白及其上游基因MDR1的表达，从根本上逆转MDR。而通过诱导细胞内源性ROS水平升高激活细胞内各相关的凋亡信号转导通路恰恰是多数抗肿瘤药物的作用机制，同时ROS又能通过多种途径下调P-gp蛋白和MDR1基因的表达，所以ROS诱导剂表现出了良好的逆转MDR的前景。Liu等［32］发现了一种逆转剂 ACMS-GOX，就是ROS生成酶，通过连续生成较低浓度的过氧化氢而逆转P-gp过表达的肿瘤细胞的MDR表型。很多研究还发现许多中药单体也具有良好的逆转MDR的活性，如粉防己碱，延胡索乙素，槲皮素，川芎嗪等［33］，其中有些单体成分也具有升高 ROS水平的功能。因此，可以看到ROS诱导剂作为逆转P-gp介导的肿瘤MDR的新的逆转剂有着良好的应用前景。但是，在使用ROS诱导剂抑制P-gp表达的同时，我们必须清醒的认识到，ROS诱导剂在升高肿瘤细胞内源性ROS的同时，其使用剂量需精确控制，因为细胞内过高的ROS水平会引发细胞的应激反应，反而使得细胞内P-gp的表达上调。所以，我们可以推测，ROS诱导剂在作为抑制P-gp的MDR逆转剂时，应该尽可能的在保证有逆转活性的前提下，使用较低剂量，以使细胞内的ROS水平不会超过生理水平过高，造成细胞的氧化应激，这样也刚好可以降低逆转剂对正常细胞的毒性和不良反应。而目前的多药耐药逆转剂往往因为最初都是有其它功效的药物，因此特异性较低，使用剂量较大，产生严重的不良反应而限制了其在临床的应用。所以ROS诱导剂在逆转肿瘤多药耐药方面有着很好的临床研究价值。

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