隐孢子虫基因分型标记的研究进展*

王 强,安春霞,菅复春,朱静静,宁长申,张龙现

隐孢子虫是一类寄生于包括人在内的各类脊椎动物消化道上皮细胞的原生动物,常引起以胃肠炎和腹泻为征的隐孢子虫病,目前已有100多个国家发现并报道了该病〔1-2〕。1998年,世界卫生组织(WHO)将人的隐孢子虫病列为艾滋病(AIDS)怀疑指标之一。2003年,我国卫生部门将其列为2个重要新发寄生虫病之一。

迄今为止,隐孢子虫有效种已达21个,基因型50多个〔3-7〕,而隐孢子虫种和基因型的命名很大程度上仍依赖于来源宿主。自然条件下,同一虫种或基因型常能感染多种动物,同类动物亦能感染不同虫种或基因型,依据形态学、生活史和寄生宿主等很难加以区分。鉴于隐孢子虫重要的公共卫生意义,对寄生于人和畜禽体内以及环境中隐孢子虫卵囊进行精确检测,并研究其宿主源和群体遗传结构尤为重要。近年来,分子标记已广泛应用于检测和区分隐孢子虫种、基因型和亚型,同时这些工具也用于隐孢子虫传播途径的研究,这使得隐孢子的公共卫生意义及人隐孢子虫病传染源得到更好界定,为控制隐孢子虫病提供了有力的技术保障〔8-9〕。本文就近年来国内外隐孢子虫基因分型标记的研究进展综述如下。

1 基因型分型工具

自1991年Laxer首次运用PCR技术检测粪便样品中隐孢子虫以来,许多研究者均以PCR方法检测临床及环境样本中的隐孢子虫卵囊〔8〕。但分子生物学技术在隐孢子虫病诊断中的广泛应用是在其用于基因分型之后才开始的。目前,常作为分子标记的基因位点主要有小亚基核糖体 rRNA(SSU rRNA)、70-kDa热休克蛋白(HSP70)、卵囊壁蛋白(COWP)、肌动蛋白(actin)、乙酰辅酶A合成酶、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶(DHFR-ts)、血小板反应蛋白-相关黏附蛋白(PRAP-C1和PRAP-C2)等编码基因、以及一些微卫星序列(SSR-1)〔8-12〕。

1.1 18S rRNA基因 18S基因编码小亚基核糖体RNA即18S rRNA,为5个拷贝重复序列,以连续排列方式存在于细胞内,长约1850bp,是唯一具有信息分子和功能分子两种作用的 rRNA基因。隐孢子虫18S基因具有高度保守性,易于PCR引物设计,几乎能鉴别区分所有隐孢子虫种类,是目前运用最广的基因位点之一〔7〕。基于18S rRNA基因位点的分子流行病学工具通常用于人、动物和水样中隐孢子虫基因型的鉴定。许多特异性的 PCRRFLP技术都是基于18S rRNA基因进行的。早期隐孢子虫种大都基于18S rRNA基因鉴定而命名,后来经其他基因位点鉴定仍然成立〔13〕。近3年来,隐孢子虫研究的116篇学术文章中有86%对18S rRNA基因进行了检测,基于该基因中约830bp一片段进行限制性内切酶消化的PCR-RFLP方法亦达70 篇论文〔7〕。2008年,Waldron 等〔14〕基于 18S rRNA建立的T-RFLP方法,通过产生的诊断性片段能够特异、快速区分C.parvum和C.hominis。但18S rRNA基因的不足之处在于不同拷贝间存在微小的序列差异,这可能导致某一虫种或基因型RFLP分析结果不一致,因此,区别不同分离株不同拷贝序列内部差异是很有必要的〔3,9〕。

1.2 HSPs 热休克蛋白家族(heat shock proteins,Hsps)是一群进化上高度保守的管家基因家族,根据其分子量不同将Hsps分为低分子量家族、中等分子量家族(如 Hsp65)、Hsp70家族、Hsp90家族和Hsp110家族,每个家族又有多个成员,其中Hsp70基因没有内含子且在进化上高度保守,一旦启动转录即可产生成熟的 mRNA来快速表达Hsp70,在隐孢子虫基因型检测中应用较广。通过对该位点补充分析,已确立许多独立种和基因型〔15〕。Glaberman 等〔16〕多位点分析 C.meleagridis,在 HSP70位点存在高度遗传异质性。同时,Hsp70也可用于隐孢子虫亚型分析,通常用于C.meleagridis亚型分析。2009年,Feng等〔15〕运用Hsp90基因位点,成功地建立一套基因分型方法,该方法能准确区分感染人的隐孢子虫种。

1.3 actin基因 肌动蛋白是真核细胞中普遍存在的高度保守的蛋白之一,其非编码序列差异大,反映进化程度。2008年,Hill等〔17〕对澳大利亚负鼠新基因型BTP1分析,actin基因分析结果表明,其与C.f ayeri负鼠基因型Ⅰ和C.parvum同源性分别为86.5%和86.5%,这与 18S rRNA基因分析结果相一致,但对卵囊量较小的BT P2分析,Actin位点未能扩增出目的片段。因actin基因位点同一基因型内变异小,从而限制其广泛运用〔8〕。

1.4 cowp基因 Xiao等〔4〕在基因分型技术评价时,成功地运用Nest-PCR扩增出cowp基因中一长约550bp的片段区分 C.parvum不同基因型、C.muris和 C.serpentis。Pedraza-Dí az 等〔18〕从 2000份人样本中分析了 cowp基因,确定所测样本中的19名患者产生不常见的RFLP片段。随后进行的DNA序列分析和其它4个基因位点分析,均确认这是和C.parvum在遗传学上有明显不同的种类,这一分离株鉴定为 C.meleagridis,其基因序列与从鸟类分离到的虫体完全相同,其卵囊形态与 C.parvum 差异很大。Leoni等〔19〕在英国历行 15年的流行病学调查研究中,发现2例C.andersoni,利用18S rRNA和 cowp基因的序列分析,均为 C.andersoni。由于其特异性差,基于cowp基因的分型工具应用相对较少,近3年来,运用该位点的文献仅占20%(23/116),且大多与18S rRNA基因结合运用〔7〕。但 cowp基因常用于新宿主C.parvum的鉴定〔7-8〕。

1.5 微管蛋白 β-微管蛋白(β-tubulin)基因微管是细胞骨架、纺锤体以及纤毛、鞭毛的主要组分,对细胞有支持作用。构成微管的微管蛋白分子含两个十分相似的亚基,即α-tubulin和β-tubulin。由于βtubulin基因既有保守的外显子又有许多内含子,已被用于原生动物的各级分类水平上的系统发育研究。Tanrivendi等〔20〕用β微管蛋白基因为靶序列,设计引物扩增(正向引物:ATGCTGTAATGGATGTAGT TAGACA;反向引物:GTCTGCAAAATACTATCTGG),同时用β微管蛋白中能区分出基因型Ⅰ和Ⅱ的49个碱基序列制成探针,并用免疫荧光标记物标记进行隐孢子虫检测。这种方法可特异地分辨出C.parvum基因Ⅰ型和Ⅱ型,且敏感性高,单卵囊即可检出。为更好了解C.parvum不同分离株之间或分离株内的异质性程度,将微小隐孢子虫β-tubulin的内含子和邻近的外显子进行测序和RFLP分析,结果不同分离株检测到不同等位基因,且在两个完全不同的分离株中发现一个β-tubulin等位基因含有亚群重组的特征,说明了不同亚群之间有重组的趋势〔7-8〕。

1.6 其他基因 在检测C.parvum基因型方面,基于DHFR基因的多重等位基因特异性PCR(MAS-PCR)方法和 cowp基因PCR-RFLP与18s rRNA基因 巢氏 RFLP方法具有同样的敏感性和特异性,并能检测到多种基因型感染。基于CP2基因的qPCR方法能特异性检测出C.parvum,该位点热稳定性好,对卵囊进行热处理48h后仍能成功鉴定且检测限为10个卵囊〔13〕。依据血小板反应相关黏附蛋白(TRAP-C2)基因的369bp片段处电泳条带,能将C.hominis与其他虫种加以区分〔21〕。另外,TRAP蛋白(thrombospondin-related adhesive protein)、PNO(pyruvate:NADP+oridoreductase,PNO)基因和一些特异位点的核酸探针也都用于隐孢子虫基因型的检测〔12〕。

2 基因亚型分型标记

基因分型工具仅能从种和基因型水平上区分隐孢子虫,随着分子生物学研究发展,亚型分析工具越来越多地应用于流行病学调研。基因亚型分型工具发展过程中主要使用以下遗传性靶基因位点,包括微卫星和小卫星、60kDa糖蛋白(GP60)基因、双链RNA成分(ds-RNA)和rRNA内部转录间隔区(ITS-2),这些目的基因比基因分型的基因位点进化率更高〔7-8〕。另外HSP70位点也可用于亚型分析。

2.1 GP60基因 GP60基因亚型彼此之间依据5'端编码丝氨酸的三核苷酸(TCA、TCG或 TCT)重复数的差异加以区分。各亚型家族不同亚型依据命名系统区分〔9〕。GP60等位基因和蛋白序列多态性高,全部序列中每个等位基因位点可根据密码子的重复数目不同而确定基因亚型〔22〕。GP60是隐孢子虫基因组中最具多态性的标记基因,是应用最广泛的隐孢子虫亚型靶基因。Sulaiman等〔21〕运用Nest-PCR方法检测C.parvum的62个分离株发现在GP60位点产生9个不同的核苷酸序列,基因亚型等位基因主要为 Ⅱa和 Ⅱd,分别为28例和29例,对于生物种群遗传结构的研究很有帮助。Strong等〔23〕基于 GP60基因的序列多态性,详细描述了隐孢子虫GP60基因的5个等位基因,其中一个包括所有C.parvum分离株(标记为Ⅱ),另外四个为C.hominis分离株(Ⅰa,Ⅰb,Ⅰc,Ⅰd)。Alves等〔24〕对葡萄牙的人和牛的隐孢子虫GP60基因亚型分析后发现 7个等位基因,发现一个新的 C.parvum 等位基因 Ⅱd,且等位基因 Ⅱb和 Ⅱd,迄今只在葡萄牙有报道。Quilez J等〔25〕对西班牙山羊和绵羊羔隐孢子虫GP60基因序列分析,新发现5个C.parvum亚型,且检测出3个常见于人分离株的C.parvum亚型(IIdA17G1a,IIdA19G1,IIdA18G1),并指明在有限的区域内C.parvum亦存在遗传多样性。GP60基因序列分析在 C.parvum人和牛基因型发现有近 100个GP60基因亚型,表明这项技术具有非常高的分辨力。遗憾的是GP60工具不能将C.parvum人和牛基因型清晰的分为两个群,因此,需要分辨力更强的位点用于亚型分型技术以更准确研究隐孢子虫亚型及其相关研究〔7〕。

2.2 微卫星序列 串联重复序列是指1-200个碱基左右的核心重复单位,以头尾相串联的方式重复多次所组成的序列。它广泛存在于真核生物和一些原核生物基因组中,并表现出种属特异性。在基因组整体水平上,不同种的优势重复序列类型不同,即使在同一重复序列内部,不同重复拷贝类别(如AT、AC等)也表现出很大差异。同时,这些重复序列类型和各重复拷贝类别在同一物种的不同染色体间以及基因的编码区和非编码区间也表现种属和碱基组成差异〔8〕。微卫星和小卫星是DNA序列包括1-4个碱基对的串联重复序列(微卫星)或更多(小卫星)。因为复制错误,这些序列进化速率普遍比其他核苷酸基因快。微卫星和小卫星的遗传变异主要是指衔接重复的变化,因此通过PCR产物分级,使用传统凝胶电泳或现代基因扫描方法均能分离鉴别亚型〔7〕。Strong 等〔23〕发现 C.hominis 分离株的 4个等位基因,在每个等位基因内,根据多个三联核苷酸串联重复分为不同基因亚型。Caccio等〔26〕对94个分离株扩增微卫星位点进行多态性分析发现,C.parvum至少应该有两个遗传群体且各遗传群体内部在串联重复和点突变的位置不同,揭示了分离株地理分布差异和宿主特异性。因此,微卫星位点分析对于隐孢子虫流行病学、传播途径及种群结构研究很有帮助。

2.3 ds-RNA和转录间隔子ITS ds-RNA和ITS-2的SSCP序列分析也用于C.parvum和C.hominis亚型分析,ds-RNA具有最高的分化能力,但其RT-PCR灵敏度低。由于其在染色体外,不能和虫体共同进化,因此,其不能将C.parvum和C.hominis明确区分开来〔7-8〕。ITS 分为 ITS-1和ITS-2两个区域,由于ITS区域既具有核苷酸序列的高度变异性又具长度上的保守性,种间变异率较种内低,且ITS区域两侧翼编码区易于通用引物设计,因此ITS区域已普遍用来分析近缘种和种群的系统发育关系。ITS-2(GenBank assession no.AF015774)含有5个拷贝数的高度变异区域最适合基因亚型分析〔7〕。Tiangtip等〔27〕对隐孢子虫 MS2,MS3和MS4基因进行研究,其序列分析表明CR2和CR9分离株属于C.meleagridis,它们有相同的ITS序列;而CR8属于C.muris,ITS存在差异。

2.4 其他位点 在 C.homimis、C.parvum、C.meleagridis多位点分析(MLST)方面,6号染色体上 GP60、CP47、CP56、TSP8(ML2)、RPGR、Mucin1、CP56、MSC6-7、DZ-HRGP、ZPT 等位点 ,2 号染色体上 HSP70小卫星位点等均具有较高特异性〔3,7-9〕。

3 工具酶

分子流行病学研究另一重要手段就是酶切鉴定,即DNA物理图谱的制作。它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示。当前,没有推荐用于隐孢子虫种类鉴定的标准遗传位点,然而建立在酶切基础之上的基于18S rRNA位点研究隐孢子虫基因型或隐匿种的PCR-RFLP技术方法在目前研究中是一个优势〔7〕。构建隐孢子虫DNA限制性内切酶图谱通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置从而鉴定隐孢子虫种〔8〕。目前,常用的 Ⅰ类酶主要有 SspI、VspI(AseI)、DdeI、DraI、RsaI、StyI、H phI、BbsI,Ⅱ类主要有 MboII〔15〕。其中运用最广的为 VspI、SspI、DdeI、MboII。VspI用于主要用于区分C.parvum和C.homimis,SspI通常用于种类诊断。通过18S rRNA巢式PCR后经SspI和VspI双酶切消化能鉴定大多数隐孢子虫和基因型,牛的样品需要SspI和MboII双酶切鉴定以区分C.parvum和C.bovis,DdeI用以区分 C.muris和 C.andersoni〔28〕。

4 展 望

分子生物学技术运用于隐孢子虫的研究已极大地提高了人们对隐孢子虫的认知水平,其与形态测定、宿主特异性、生物学特征研究等互补使得隐孢子虫分类和种类鉴定更为科学、准确〔7,29〕。隐孢子虫基因分型标记的发展,对于理解隐孢子虫生物学及流行病学有着至关重要的作用,现在我们能从基因型和亚型水平上理解隐孢子虫的传播途径、群体结构和宿主相互作用机制〔30-31〕。第二代分子生物学技术与传统流行病学调查相结合有着无比广阔的前景,新一代基因型和亚型工具在流行病学研究的广泛运用必将使人们对人和动物的隐孢子虫病有更深层次的理解。

〔1〕Soba B,Logar J.Genetic classification of Cryptosporidium isolates from humans and calves in Slovenia〔J〕.Parasitology,2008,135(11):1263-1270.

〔2〕Xiao L,Fayer R,Ry an U,et al.Cry ptosporidium taxonomy:recent advances and implications for public health 〔J〕.Clin Microbiol Rev,2004,17(1):72-97.

〔3〕Fayer R,Santin M,Xiao L.Cry ptosporidium bovi s.sp.(Apicomplexa:Cryptospo ridiidae)in cattle(Bos taurus)〔J〕.J Parasitol,2005,91(3):624-629.

〔4〕Xiao L,Fayer R.Cry ptosporidium Tax onomy:Recent Advances and Implications for Public Health 〔J〕.Clin Microbiol Reviews,2004,17:72-97.

〔5〕Ryan UM,Power M,Xiao L.Cryptosporidium fayeri n.sp.(Apicomplexa:Cryptosporidiidae)from the Red Kangaroo(Macropus rufus)〔J〕.J Eukaryot Microbiol,2008,55(1):22-26.

〔6〕Xiao L,Fayer R.M olecular characterisation of species and genoty pes of Cry ptosporidium and Giardia and assessment of zoonotic transmission〔J〕.International Journal for Parasitology,2008,38:1239-1255.

〔7〕Xiao L.Molecular epidemiology of cry ptosporidiosis:An update〔J〕.Exp.Parasitol,2009,doi:10.1016.

〔8〕Smith HV,Cacciò SM,T ait A.Tools for investigating the environmental transmission of Cry ptosporidium and Giardia infections in humans〔J〕.Trends Parasitol,2006,22(4):160-167.

〔9〕Abe N,Matsubayashi M,Kimata I.Subgenotype analy sis of Cryptosporidium parvum isolates from humans and animals in Japan using the 60-kDa glycoprotein gene sequences〔J〕.Parasitol Res,2006,99(3):303-305.

〔10〕Cohen S,Dalle F,Gallay A.Identification of Cpgp40/15 Ty pe Ib as the predominant allele in isolates of Cryptosporidium spp.from a waterborne outbreak of gastroenteritis in South Burgundy,France〔J〕.J Clin Microbiol,2006,44(2):589-591.

〔11〕Muthusamy D,Rao SS,Ramani S.Multilocus genotyping of Cry ptosporidium sp.isolates from human immunodeficiency virus-infected individuals in South India 〔J〕.J Clin Microbiol,2006,44(2):632-634.

〔12〕Jex A R,Gasser RB.Diagnostic and analy tical mutation scanning of Cryptosporidium:utility and advantages〔J〕.Ex pert Rev Mol Diagn,2009,9(2):179-185.

〔13〕Lee SU,Joung M,Ahn MH,et al.CP2 gene as a useful viability marker for Cryptosporidium parvum 〔J〕.Parasitol Res,2008,102:381 387.

〔14〕Waldron LS,Ferrari BC,Gilling s MR,et al.Terminal restriction fragment length polymorphism for identification of Cry ptosporidium species in human feces〔J〕.Appl Environ Microbiol,2009,75(1):108-112.

〔15〕Feng Y,Dearen T,Cama V,et al.90-kilodalton heat shock protein,Hsp90,as a target for genotyping Cry ptosporidium spp.known to infect humans〔J〕.Eukaryot Cell,2009,8(4):478-482.

〔16〕Glaberman S,Sulaiman IM,Bern C,et al.A multilocus genotypic analy sis of Cryptosporidium meleagridis〔J〕.J Eukaryot Microbiol,2001,l:19S-22S.

〔17〕Hill NJ,Deane EM,Power M L.Prevalence and genetic characterization of Cryptosporidium isolates from common brushtail possums(Trichosurus vulpecula)adapted to urban settings〔J〕.Appl Environ Microbiol,2008,74(17):5549-5555.

〔18〕Pedraza-Díaz S,Amar CF,McLauchlin J,et al.Cryptosporidium meleagridis from humans:molecular analysis and description of affected patients〔J〕.J Infect,2001,42(4):243-250.

〔19〕Leoni F,Amar C,Nichols G,et al.Genetic analy sis of Cry ptosporidium from 2414 humans with diarrhoea in England between 1985 and 2000 〔J〕.J Med Microbiol,2006,55(6):703-707.

〔20〕Tanriverdi S,Tanyeli A,Baslamisli F,et al.Detection and genotyping of oocysts of Cryptosporidium parvum by real-time PCR and melting curve analysis〔J〕.J Clin Microbiol,2002,40(9):3237-3244.

〔21〕Sulaiman IM,Hira P R,Zhou L,et al.Unique endemicity of cryptospo ridiosis in children in Kuwait.〔J〕.J Clin Microbiol,2005,43(6):2805-2809.

〔22〕Zintl A,Proctor AF,Read C,et al.T he prevalence of Cryptosporidium species and subtypes in human faecal samples in Ireland〔J〕.Epidemiol Infect,2009,137,270-277.

〔23〕Strong WB,Gut J,Nelson RG.Cloning and sequence analysis of a highly polymorphic Cry ptosporidium parvum gene encoding a 60-kilodalton glycoprotein and characterization of its 15-and45-kilodalton zoite surface antigen products〔J〕.Infect Immun,2000,68(7):4117-4134.

〔24〕Alves M,Xiao L,Antunes F,et al.Distribution of Cry ptosporidium subtypes in humans and domestic and wild ruminants in Portugal〔J〕.Parasitol Res,2006,99(3):287-292.

〔25〕Qu í lez J,Torres E,Chalmers RM.Cry ptosporidium genotypes and subtypes in lambs and goat kids in Spain 〔J〕.Appl Environ Microbiol,2008,74(19):6026-6031.

〔26〕Cacciò SM.Molecular epidemiology of human cryptosporidiosis〔J〕.Parasitologia,2005,47:185-192.

〔27〕Tiangtip R,Jongwutiwes S.Molecular analysis of Cry ptosporidium species isolated from HIV-infected patients in T hailand〔J〕.T rop Med Int Health,2002,7(4):357-364.

〔28〕Feng Y,Ortega Y,He G,et al.Wide geographic distribution of Cryptosporidium bov is and the deer-like genoty pe in bovines〔J〕.Vet Parasitol,2007.144(1-2):1-9.

〔29〕Waldron LS,Ferrari BC,Power M L.Gly coprotein 60 diversity in C.hominis and C.parvum causing human cry ptosporidiosis in NSW Australia〔J〕.Experimental Parasitology,2009,122,124-127.

〔30〕Brook EJ,Anthony Hart C,French NP,et al.Molecular epidemiology of Cryptosporidium subtypes in cattle in England〔J〕.Vet J,2009,179(3):378-382.

〔31〕王进产,张龙现,赵金凤,等.基于PNO基因序列分析隐孢子虫种系发育关系〔J〕.寄生虫与医学昆虫学报,2008,15(1):20-25.