脊髓损伤动物模型的建立及其评价

田伟,张焱,孙岚,王征美

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种致残率很高的疾病,给家庭、社会均带来沉重的负担。随着工业、建筑业和交通运输的飞速发展,脊髓损伤患者数量呈逐年上升趋势。由于脊髓是神经功能的中间通路,脊髓损伤可以直接导致神经功能损伤,从而引起组织、器官功能障碍。传统观念认为,哺乳动物的脊髓损伤后不能再生,导致其后期功能恢复的预后较差。近年来实验研究证实,中枢神经损伤后具有一定的再生能力。建立一种可靠性高、重复性好的动物模型,对研究脊髓损伤具有十分重要的理论价值和临床意义。

1 动物的选择

选择实验动物主要考虑两个方面的因素:其生物学特点是否接近人类;实验动物的来源及其价格状况。

从解剖生理上讲,进行脊髓损伤研究最理想的实验动物是灵长类动物,如猿、猩猩、猴等,因为越是高等动物如狗、猴等动物,越接近人类,就越容易和可靠地观察脊髓损伤的功能改变,即行为学变化及其恢复情况;且这类动物不仅体型大,在手术操作实感上也与人极为相似。但其价格昂贵,难以获得,因而难被推广使用。目前我国脊髓损伤实验研究最常选用的动物是大白鼠,因为它们具有成本低、种系内纯合性好、基因学和生理特性较接近人类,且具有较强的抗感染能力和生命力,便于管理的特点;选用品质纯正的大鼠,适用于电生理和单克隆抗体、原位杂交反应、转基因、基因失效等基因工程和分子生物学研究,且价格经济;其他依次是兔、猫、犬。这些动物高级神经系统较发达,且价格相对便宜,较易获得。

2 复制脊髓损伤模型的要求

研究脊髓损伤最基本的条件是建立标准、理想的脊髓损伤模型。早在1911年,Allen曾用重物撞击法首次在实验动物身上复制出脊髓损伤模型。此后随着对脊髓损伤研究的不断深入,国内外学者不断设计出各种各样的脊髓损伤模型。理想的模型应符合以下要求。

2.1 临床相似性 即脊髓损伤模型的制作过程与临床脊髓损伤过程相近似,动物的手术创伤尽可能少。临床上脊髓损伤的致伤因素很多,因此脊髓损伤的研究需要设计出各种各样与之相适应的模型,如设计静压型脊髓损伤模型以研究骨折碎片、脱出椎间盘或占位病变对脊髓的压迫损伤;设计牵张性脊髓损伤模型,用以研究脊柱矫形器的过度撑开作用所致的脊髓牵张性损伤等。

2.2 可调控性 即损伤程度可自由控制,用同一方法不同程度的致伤量作用动物脊髓同一节段产生不同程度的脊髓损伤,致伤量大小与脊髓损伤程度成线性关系,以便复制出不同损伤程度的脊髓损伤模型。

2.3 可重复性 即对脊髓损伤模型制作的关键步骤客观化、定量化,模型制备时操作技术简单,重复性好,易于掌握,便于推广。

2.4 可操作性 操作简单,即所用设备要求不高,操作不繁琐,能快速大批制作。死亡率低,并发症少。脊髓损伤后实验动物的死亡率常高于15%,同时脊髓损伤并发症多,严重影响了实验结果,因此,降低死亡率,减少并发症也是脊髓损伤动物模型制作的关键。

3 脊髓损伤动物模型制备

针对不同的临床问题,可选择不同的实验模型;动物模型的选择对研究结果具有重要的影响。

3.1 脊髓撞击伤模型 脊髓撞击伤模型是通过用重物撞击脊髓造成脊髓损伤而制成的脊髓损伤动物模型,最早由Allen创建,以一个有刻度的套管确定重物坠落高度,自由下落,打击置于脊髓上的击板而间接打击脊髓,造成损伤。此方法简单易行,易于复制,与人类脊髓损伤发生相近。通过调整重锤的重量和撞击高度可改变撞击能量;也可通过调整打击板的大小、形状等来调整撞击的部位和范围。由于不打开硬脊膜,可防止结缔组织或其他外来成份侵入损伤脊髓。该模型较为接近人类脊髓损伤的病理生理特点及变化规律:早期组织水肿、出血、坏死,随后阶段性部分修复、组织重建,最后慢性坏死囊腔形成、实质细胞萎缩、胶质瘢痕形成,其组织损伤的时空效应与人类脊髓损伤有较好的一致性。因此,该模型可用于脊髓损伤的病理生理机制和实验性治疗研究,是目前与临床脊髓损伤相关性较好的一种模型。

其缺点是:重物打击的瞬间,脊柱脊髓的偏移常常造成致伤结果的不一致性,而且同样的势能造成的损伤程度往往相差很大。为了减少模型间差异,Gruner在Allen基础上创造了Now York University碰撞器[1],其优点在于能够监控损伤参数,如碰撞速度和组织位移,使制作的模型更加符合预设标准,减少损伤多样性,是一种标准化的制作脊髓损伤模型的仪器,已被脊髓损伤研究者广泛应用。尽管如此,该模型仅仅模拟致伤时的最初打击状态,忽略了持续性的挤压作用;而在人类急性脊髓损伤往往因脊柱骨折存在着持续性的挤压作用。

3.2 脊髓压迫伤模型 脊髓压迫是导致脊髓损伤的重要原因之一。该损伤模型主要为模拟椎管内占位性病变造成的脊髓损伤。可分为急性压迫伤和慢性压迫伤。压迫方法一般是通过异物植入的方式,如植入膨胀的球囊、不锈钢螺钉、肿瘤细胞、硅胶片等。急性压迫的病理生理过程与脊髓撞击模型较为相似;但慢性脊髓压迫为非瞬间损伤,便于进行神经功能和代谢改变的检测。

球囊压迫方法最早于1953年由Tadov等[2]应用:将一个可膨胀的气球放入椎骨与硬脊膜之间,以不同速率向气球充气使其膨胀,导致不同程度的脊髓损伤。此方法可在脊髓任何部位致伤,球囊气体注入量或压迫时间可任意选择,操作方法简便,实验结果重复性好。此模型常用于撞击与压迫对脊髓损伤机制的对比研究。在Tadov之后,Seijun等应用球囊式导管经过椎间孔置入L1水平的硬膜外隙,然后注入生理盐水,根据注入生理盐水量的不同,即可造成轻度、中度、重度的脊髓损伤模型[3]。田伟等将带有金属丝的硅胶片通过黄韧带植入椎管中,造成脊髓压迫模型[4],该方法不用打开椎板,这样既可以减少手术创伤又可以简化操作,不但可以准确定位,而且手术重复性好,死亡率低,模型较均一。这几种方法的特点在于植入异物首先造成的是一个急性压迫,其后才是持续的慢性压迫,这与临床急性椎间盘突出、脱出造成脊髓受压的病理过程较为相似。

不锈钢螺钉压迫脊髓,1990年由Hashimoto应用于大鼠T11水平脊髓,为渐进型脊髓压迫所致脊髓损伤提供了一个实用且简单的模型。河南医科大学孔抗美等将此模型进行改进,后路安装有机玻璃平板固定的不锈钢螺钉压迫装置,造成渐进型脊髓受压模型[5]。该模型虽能较好地模拟慢性压迫的自然进程,但增加了手术次数和创伤。

Uchida等利用转基因的小鼠作为慢性压迫性颈髓损伤模型来对脊髓压迫性疾病进行研究,培养出的转基因小鼠随着年龄的增长,颈椎体内钙化沉积物增多,从而产生脊髓压迫[6]。该模型能较好地模拟慢性椎间盘突出、黄韧带肥厚等疾病的自然病程,是一种较为理想的慢性压迫性脊髓损伤实验动物模型。

3.3 钳夹型脊髓损伤模型 有学者将该方法纳入脊髓压迫模型,因其可行压迫后减压,故将其单独提出。Rivlin等使用改装的动脉瘤夹,直接钳夹脊髓,可以反映不同钳夹力、不同的压迫时间与脊髓损伤程度的关系[7]。Sheng等制备了微创的鼠脊髓损伤模型,通过切开棘间韧带暴露硬膜外隙,而不进行椎板切除,垂直于脊髓纵轴在T11水平的硬膜外隙放置1.5 mm的硅胶管;在放置硅胶管之前,用缝合线穿过硅胶管;在脊髓压迫之后的1、30、60和120 min的时候,撤除硅胶管。在损伤后 1、3、7和14 d评测神经系统功能并进行组织学分析。BBB运动评分等随时间而逐渐恶化,组织学分析表明,腹侧角的正常神经元逐渐减少,细胞坏死横断面积增加[8]。其后李刚等用动脉瘤夹建立模型,造成接近于日常生活中人体脊髓损伤的类型[9],在研究脊髓损伤后急性期的病理生理变化、解除钳夹压迫的时机及电刺激和神经保护性干预等方面具有重要作用。制作该模型的关键是钳夹的部位与压力大小的确定。此类模型多为闭合性损伤,但为非瞬间损伤,既有机械压迫所致的原发性损伤,又有受压后引发的继发性损伤,与临床较为相似,便于进行神经功能和代谢改变的研究和检测[10]。

3.4 脊髓横断损伤 脊髓组织在解剖学上的连接中断为横断损伤,见于严重的钝性打击伤、切割伤及火器伤。随着对中枢神经损伤后修复的重新认识,越来越多的学者致力于脊髓损伤后神经再生的有关研究,进行了大量的动物试验,主要采用锐利的刀片选择性将脊髓进行全横切、半横切、部分切断或造成块状缺损,形成脊髓横断性、半横断损伤或脊髓缺损,从而观察损伤轴突再生、突触重建及有关神经递质、神经营养因子、神经组织、细胞移植对这一过程的影响及作用。脊髓横断损伤特点在于伤口整齐,出血较少,且操作简便、重复性好,损伤程度较恒定,解剖定位准确,功能障碍亦确定,便于进行脊髓损伤的基础理论研究和神经生物学的研究。尤其是半横断损伤还可以与健侧对照,具有独特的优越性。但该模型损伤硬脊膜,破坏了相对独立的中枢环境,与临床相关性差,难以复制出与临床相似、可量化的脊髓损伤模型,且死亡率较高。

3.5 脊髓牵拉损伤实验模型 脊柱过度牵拉致脊髓损伤最早发现于脊柱侧弯矫形术中,以医源性多见。脊髓牵拉损伤模型用牵开器由侧方牵拉脊髓,实现水平方向上的脊髓牵拉损伤;选用不同的牵拉比率可以复制出不同程度的牵拉性脊髓损伤。此模型模拟了临床状态下脊髓损伤的致伤条件和受伤机制。Dolan等设计特殊牵拉装置,固定损伤点上、下椎体并向相反方向牵拉脊柱,结果发现随着牵开距离的增大,脊髓损伤的程度逐渐增加,损伤区血流逐渐减少,表明损伤区缺血是脊柱过度牵拉导致脊髓功能丧失的主要原因[11]。周子强等用模拟神经拉钩特制的牵开器由侧方牵拉脊髓,实现水平方向上的脊髓牵拉性损伤[12]。此模型成功模拟了临床状态下脊髓损伤的致伤条件和受伤机制,不足之处是由于动物个体耐受不一致,因而牵拉比率的精确性难以控制。

3.6 脊髓缺血性损伤 实验表明,脊髓损伤除了原发性机械因素外,创伤后的脊髓缺血缺氧造成的继发性细胞损害是导致原本可逆的感觉运动功能障碍转变为永久性的功能丧失的主要原因。研究者对脊髓缺血损伤模型做了大量的研究,主要方法是夹闭动脉。Zivin等对兔肾动脉水平的腹主动脉用Scoville-Lewis动脉瘤夹夹闭的方法制作了脊髓损伤模型[13]。此方法建立模型简单,具有高度的可重复性,模型可以长期进行临床跟踪,功能丧失固定,不发生惊厥。此种模型特别适合应用于神经化学、神经病理学和神经生理学的研究。除了夹闭主动脉外,还有可以制备不同损伤程度的可复制的脊髓缺血性损伤模型方法——球囊阻塞法。1997年,Kanellopoulos即用这种方法阻塞大鼠近端胸降主动脉,成功制作了脊髓缺血性损伤模型[14]。其后Lazdunski首次用小鼠成功建立了脊髓缺血性损伤模型[15]。钳闭小鼠主动脉弓、左锁骨下动脉和乳房内动脉,之后再灌注。应用小鼠制作此种脊髓损伤模型成本低,然而,但在制作模型时小鼠会产生肠缺血,使在评价神经保护药物药效方面的应用受到限制。

除此之外,还有脊髓震荡型损伤模型[16]、光化学诱导型脊髓损伤模型[17]等,由于与临床自然病程有一点差距,就不再赘述。近年来脊髓损伤模型的构建方法不断改进,发展出多种造模方法,但主要是机械方法造成脊髓损伤。对于造模方法的改进也主要集中在这些机械方法如何能够更加标准化以减少模型间差异,如何能够更加准确地定位损伤部位,如何使模型损伤程度得到更好的控制,以及提高可重复性的问题上。

4 小结

建立理想的动物模型是研究脊髓损伤的基本条件,只有在相同的动物实验模型条件下,才能更好地研究脊髓损伤机制,观察损伤后病理生理改变,从而找出可靠的、灵敏的可直接判断脊髓损伤程度的方法,以及优选出治疗脊髓损伤的最佳方案。目前在脊髓损伤的实验研究中,动物模型种类较多,每种模型仅能代表脊髓损伤的某一方面,各有其优缺点。今后研制动物模型应在模拟临床损伤机制的基础上,尽量简化操作步骤,制造出更加接近疾病的自然进程、更加可靠、更加标准化、可调控、可复制的脊髓损伤模型。总之,我们在制备脊髓损伤模型时,要根据实验目的和具体的实验条件做出科学的选择。

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