蛋白质组学在结直肠癌生物标志物研究中的应用

黄利勇 综述 蔡三军 审校

复旦大学附属肿瘤医院大肠外科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的一门崭新的生命科学，正逐渐成为后基因组时代的研究热点。蛋白质组学技术不断发展，已越来越广泛地被应用于人类恶性肿瘤的研究领域。结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，本文总结了近年来蛋白质组学在结直肠癌生物标志物研究中的应用。

1 蛋白质组学的主要技术 蛋白质组学技术的飞速发展，很大程度上是建立在质谱技术不断改进的基础之上。此外，不断完善的生物信息学也为繁杂的数据分析提供了强大的技术支持。

1.1 蛋白质样品的制备技术 样品的制备在任何一种蛋白质组学研究中都是至关重要的一步，可直接影响实验结果的重复性［1］。目前已普遍应用的钙沉积和免疫磁性分离技术都是获取高纯度样本的方法。激光捕获微切割技术（laser capture microdissection，LCM）的出现可使研究者从复杂的组织样本中获得均一的肿瘤细胞，从而避免了其他混杂细胞的影响，保证了研究结果的准确性。

1.2 双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE） 虽然双向凝胶电泳的出现迄今已有约30年的时间，但其仍然是蛋白质组学研究领域中一项广泛应用的技术。其基本原理是根据等电点和分子量的不同将复杂的蛋白质样品在聚丙烯酰胺胶上分离。随着其技术的不断完善，双向凝胶电泳的分辨率、敏感度及可重复性都得到了明显的提高，但其仍存在明显不足之处：不能有效地分离出极酸和极碱性蛋白；低丰度蛋白不易检出。此外，2-DE工作量大，操作费时、费力。

1.3 差异凝胶电泳（two-dimensional difference gel electrophoresis 2D-DIGE） 此技术是在双向凝胶电泳基础上发展而来的一项新技术。其特点是可将3种待比较的蛋白样品用不同的荧光染料分别标记后在同一块凝胶上行双向电泳，通过激发不同荧光染料所得到的荧光强度从而达到蛋白质差异比较的目的。由于是在同一块胶上同时进行3种样品分析，减少了跑胶次数及不同胶上蛋白点阵的变异，使得结果更加准确［2］，即节约时间，又提高了可重复性，大有取代传统的双向凝胶电泳趋势。其缺点是分析的通量低。

1.4 多维蛋白质鉴定技术（multidimensional protein identification technology，MudPIT） 此技术是近几年逐渐得到应用的一项具有高度灵敏性的蛋白质组学技术［3-4］。基本原理为样品首先经特异性蛋白酶消化：第一向通过等电聚焦对不同等电点的蛋白质分离；第二向根据疏水性的不同再次分离蛋白质；第三向利用电喷雾离子化飞行时间质谱测量蛋白质的相对分子量并对其进行定量。此项技术灵敏度高，适用于高分子量及低分子量蛋白质的分离，并且实现了仪器的自动化操作，较传统的电泳技术具有明显优势，正受到越来越多的学者的青睐。但其也存在分析的通量低、耗时等不足。

1.5 表面增强激光解析电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOFMS） SELDI-TOF-MS是近几年兴起的一项具有应用前景的蛋白质组学技术，由蛋白质芯片、飞行时间质谱和相应分析软件3部分组成。基本原理是基于蛋白质芯片的特异性吸附作用，加上能量吸收剂后经激光脉冲辐射使被结合的蛋白质解析形成离子，根据质荷比不同的离子在真空场中飞行的时间长短不一而绘制成质谱图，最后经软件分析便可得到蛋白质相关信息。SELDI-TOF-MS具有操作简便、通量高、样本用量少，可直接对体液如血清、尿液和组织液等进行检测，目前已在不同肿瘤早期诊断的研究中得到了很好的应用［5,8-10］。

2 蛋白质组学在结直肠癌生物标志物研究中的应用 迄今为止，已有很多研究小组报道了应用蛋白质组学技术研究结直肠癌所取得的成果，这些成果主要集中在发掘新的结直肠癌生物标志物方面。

2.1 结直肠癌的诊断与鉴别诊断 Stulik等［6］较早的利用2-DE结合质谱的方法对结直肠癌组织及邻近的正常粘膜组织进行蛋白质组学比较研究。研究发现与正常黏膜组织相比，HSP70、 S100A9、 S100A8、S100A11和S100A6在癌组织中表达量显著增加，而肝脏脂肪酸结合蛋白、肌动结合蛋白和环氧合酶2表达显著下降。Alfonso等［7］采用2D-DIGE的方法比较了7例结直肠癌组织和癌旁正常黏膜组织的蛋白表达，发现了41种差异表达蛋白质，可作为潜在的结直肠癌早期诊断生物标志物。这些蛋白主要涉及细胞转录调节（转移相关蛋白1、滑液肉瘤X5蛋白），细胞信号转导（钙依赖磷脂结合蛋白Ⅳ和Ⅴ及松弛素），细胞改造和细胞骨架（细胞角蛋白、波形蛋白和β-肌动蛋白）的形成，蛋白质合成和折叠（热休克蛋白、组织蛋白酶和钙网织蛋白）。

Engwegen等［8］用SELDI-TOF-MS技术对2组独立的血清标本（A组为40例结直肠癌患者血清、49例健康人血清，B组为37例结直肠癌患者血清、31例健康人血清）分别进行研究，得到由蛋白质荷比为3 100、3 300、4 500、6 600和28 000构成的分类树，其诊断结直肠癌的灵敏度和特异度在65%~90%之间。研究者还发现这些表达特异的蛋白质有别于其他类型肿瘤，亦可作为结直肠癌的鉴别诊断之用。最近，2项独立的研究［9-10］几乎同时报道了人类中性粒细胞肽（HNP）1、2、3（或称之为α防御素1、2、3），相对于正常对照样本，其不仅在结直肠癌组织中表达量增高，而且在结直肠癌患者血清中同样也是增高的。这也表明了癌组织与血清的蛋白表达之间有一定的关联性。对于同时在组织和血清中表达都显著增高的人类中性粒细胞肽，其作为结直肠癌生物诊断的标志物应该具有很大的临床意义；然而，在某些情况下（如感染时），其在血清中的表达也会增加，同时，血清学中的蛋白质组学研究远比组织中要复杂［11］。故HNP 1、2、3作为结直肠癌早期诊断的血清生物标志物的应用价值受到质疑，有待进一步研究。

最近，Roblick等［12］报道了1例将蛋白质组学实际应用于临床鉴别诊断中的实例：对于1例侵及左侧卵巢及乙状结肠的盆腔低分化腺癌，利用常规病理检查及免疫组织化学方法都不能明确辨别其是来源于卵巢还是肠道。作者用8例结肠癌和7例卵巢腺癌组织样本进行2-DE分离蛋白后作为对照，与此例盆腔肿瘤组织的2-DE图像比对，结果发现此病例有超过89%蛋白点与结肠癌匹配，而仅有63%的点与卵巢癌匹配，进一步行主成分分析后发现其蛋白集聚性与结肠癌完全一致，而与卵巢癌则不完全相同，从而确定了此例肿瘤源于结肠，由此患者在手术后接受了正确的辅助治疗。此研究提示组织2-DE蛋白表达谱像结合主成分分析在鉴别低分化腺癌来源方面具有临床应用前景。

2.2 结直肠癌转移的研究 Pei等［13］对与结直肠癌淋巴结转移相关的蛋白标志物进行了研究。研究组以术后病理证实有淋巴结转移及无淋巴结转移各5例患者的癌组织为研究对象，经2-DE分离蛋白后结合质谱鉴定，发现热休克蛋白-27、谷胱甘肽S转移酶、膜联蛋白Ⅱ在淋巴结转移的癌组织中表达明显增高，而肝脂肪酸结合蛋白则明显下调，此结果在组织芯片免疫组织化学检测中得到证实，提示上述蛋白质表达差异可能与结直肠癌的淋巴结转移有关。

Kang等［14］则对结直肠癌肝转移作了相应研究。作者以14例结直肠癌组织标本按是否存在肝转移分成2组各7例，进行蛋白质组学差异分析，发现PI3K/AKT细胞通路上的3个重要蛋白（磷酸化IκBα、肿瘤坏死因子-α和微原纤维相关蛋白-3）表达在2组间存在显著差异。随后作者以这3个蛋白的表达差异为一整体，在含有105例独立样本的结直肠癌组织中进行结果验证，其在判断肝转移的敏感度达(92.85±4.87)%，特异度达(94.94±2.5)%。这表明以上3个蛋白在癌组织中的整体表达差异可作为判断原发结直肠癌是否存在肝转移的标志物。

2.3 判断结直肠癌预后 Kim等［15］在对14例结直肠癌患者癌组织及癌旁正常黏膜组织进行2-DE比较后发现有14个点的蛋白质表达存在明显差异，经鉴定后发现硒结合蛋白1（SELENBP1）在14例癌组织的12例中表达明显下调。随后作者进一步在包含240例的结直肠癌组织芯片中对其检测，发现癌组织中SELENBP1表达明显下降的病例其5年生存率明显低于SELENBP1表达高的病例，由此得出SELENBP1的低表达是结直肠黏膜癌变过程中的常见且提示预后不良的事件，其与结直肠癌病情的快速进展有关。

最近国内有学者［16］用相同的方法在对10例结直肠癌患者的癌组织及癌旁组织进行蛋白质组学研究中，发现并验证了索蛋白（Desmin）在癌组织中显著高表达。研究者进一步进行免疫组织化学检测后发现Desmin在癌组织中的表达水平与临床病理分期及肿瘤细胞的分化程度密切相关，分期越晚、肿瘤细胞分化程度越低则Desmin表达水平越高，同时生存分析显示Desmin高表达的患者其5年生存率显著降低。此项研究结果提示Desmin是具有判断结直肠癌患者预后意义的分子标志物。

2.4 指导结直肠癌的个体化治疗 Allal等［17］以局部进展期直肠癌患者为研究对象，术前新辅助放疗后根据疗效评价分成2组，进行蛋白表达差异分析，发现了与放疗不敏感的相关蛋白质生物标志物：热休克蛋白、β-微管蛋白、钙依赖磷脂结合蛋白Ⅴ和原肌球调节蛋白；与放疗敏感的相关标志物：Ⅰ型角蛋白、切迹2蛋白同系物和DNA修复蛋白RAD51L3。基于上述结果，研究者有望制造出可以对局部进展期直肠癌患者进行术前放疗敏感性筛查的生物芯片，这将有助于直肠癌患者的个体化治疗。

Tanaka等［18］对化疗药物5-FU敏感的结直肠癌细胞株DLD-1和对5-FU耐药的DLD-1/5-FU细胞株之间进行了蛋白质组学研究，发现DLD-1/5-FU细胞株中有5种蛋白（核内核糖核蛋白G、线粒体转录因子A、组蛋白H2B、组蛋白H4和核糖体蛋白L3）表达较DLD-1细胞株显著增高，提示这5种蛋白与肿瘤细胞对化疗药物5-FU的耐药有关，这将在临床医师制定个体化的化疗方案方面具有潜在的指导意义。

3 问题与展望 蛋白质组学研究为研究者们提供了很好的蛋白质分离与分析手段。但是，蛋白质组学仍存在技术上的瓶颈，如低丰度蛋白质的分辨、有效的分子量检测范围等方面的限制。伴随着近几年蛋白质组学技术的不断改进以及具有更高灵敏度与特异度的新技术的涌现，技术上的限制正逐步得到解决，这将会为发掘蛋白质标志物的研究敞开大门［19］。

蛋白质组学在肿瘤生物标志物的发现及检测方面具有不可替代的优势。其应用于结直肠癌生物标志物方面的研究，最终目的是有助于结直肠癌患者的诊断与鉴别诊断、转移的研究、判断预后以及个体化治疗等方面提供依据［20］。虽然它在结直肠癌中的研究还处于起步阶段，但是已经取得了可喜的科学成果，目前已发现并鉴定出了很多有意义的生物标志物，并且很多研究成果已经开始应用于基础和临床工作中，使结直肠癌医学分子水平的研究进入到了崭新阶段。随着越来越多的研究成果的报道，我们有理由相信其临床应用前景必将更加广阔。

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