当归多糖的超声提取及含量测定

何先元，许晋芳，王秋霜，陈媛媛

(重庆医科大学中医药学院，重庆 401331)

当归为伞形科植物当归 Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，为中医传统常用补血药，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效，用于治疗血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调、经闭痛经、虚寒腹痛、肠燥便秘、风湿痹痛、跌扑损伤、痈疽疮疡[1]。当归的主要成分为阿魏酸、挥发油糖、多糖等。现代药理学研究表明，当归多糖具有多种免疫活性，对造血系统有明显作用，对抗肿瘤、抗辐射损伤也有较好的疗效。笔者以超声提取-分光光度法测定当归多糖含量，为其开发利用提供参考[2-4]。

1 仪器与试药

WFZ UV-2000型紫外光分光光度计(龙尼科上海仪器有限公司);SK8200H型超声仪(上海科岛超声仪有限公司);KQ-5200DA型超声波清洗仪(江苏昆山);TDZ 4A-WS型低速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);CS 101-2EBN型电热鼓风干燥箱(重庆永生);HZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)。葡萄糖对照品(分析纯，105℃干燥至恒重);当归供试品(粉碎成粗粒，过40目筛，60℃烘3 h);乙醇(80%，95%)、5%苯酚、硫酸、石油醚、氯仿、1%活性炭、无水乙醇、乙醚、丙酮均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 当归多糖的提取与精制

称取当归200 g，置圆底烧瓶中，加石油醚500 mL，75℃回流1 h脱脂，过滤，残渣挥干溶剂，然后用80%的乙醇500 mL浸渍过夜，超声提取2次，每次1 h，过滤，药渣加蒸馏水1 000 mL浸渍1 h，超声提取30 min，过滤，再加500 mL蒸馏水，超声提取30 min，过滤，合并滤液，减压浓缩至150 mL，用氯仿萃取3次，以除去蛋白质。加1%活性炭脱色2次，抽滤，滤液加乙醇使含醇量达80%，于冰箱中静置过夜，过滤，残渣先后用95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤，60℃ 烘干至恒重，即得精制当归多糖。

2.2 溶液制备

精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖对照品25.0 mg，置250 mL量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得对照品溶液。取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.2 g，蒸馏，收集182℃馏分5 g，加100 mL蒸馏水溶解，置棕色试剂瓶中，制成5%苯酚溶液，冷藏待用。取样品粉末(过40目筛)，60℃下干燥3 h，精密称取0.262 9 g，置锥形瓶中，加80%的乙醇50 mL，超声提取30 min，过滤，残渣及滤纸加蒸馏水80 mL，超声提取30 min，滤过，再加水80 mL超声提取30 min，残渣及滤纸用水洗涤(15 mL×4次)，洗液并入滤液，合并两次提取液，然后定容于250 mL量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 换算因子测定

精密称取60℃下干燥至恒重的精制当归多糖14.3 mg，置50 mL量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀后作为贮备液。精密吸取贮备液2 mL，按标准曲线绘制方法操作，用回归方程求出多糖供试品溶液的葡萄糖质量浓度，按公式 f=W/(C·D)计算。式中 W为多糖的质量(μg)，C为多糖稀释液中葡萄糖的质量浓度(μg/mL)，D为多糖的稀释因子。换算因子 f=36.08。

2.4 方法学考察

标准曲线绘制:精密吸取对照品溶液 0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1 mL，分置50 mL具塞试管中，依次加蒸馏水补足至2 mL，各管再加5%苯酚溶液1.6 mL，摇匀，迅速加浓硫酸6 mL，常温放置25 min，于490 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，以吸光度(A)对葡萄糖质量浓度(C)进行回归，得回归方程 Y=0.691 7 X-0.0971，R2=0.9776(n=6)。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后0，1，2，4，8，24 h时依法测定其吸光度。结果的 RSD为3.13%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

精密度试验:精密吸取对照品溶液，依法重复测定吸光度。结果的 RSD为0.86%(n=5)。

加样回收试验:精密称取已知含量的样品粉末0.122 2 g，精制当归多糖31.7 mg，置同一锥形瓶中，按供试品溶液制备及含量测定方法操作，计算含量及回收率。结果回收率范围为98.44%～99.90%，平均回收率为99.85%，RSD为0.80%(n=3)。

2.5 样品含量测定

精密吸取供试品溶液2 mL，按标准曲线绘制项下方法操作，测定吸光度，用回归方程求出葡萄糖含量，计算样品中多糖含量。多糖含量(%)=C·D·f/W×100%，式中 W为供试品的质量(μg)，C为供试品溶液中葡萄糖的质量浓度(μg/mL)，D为供试品的稀释因子，f为换算因子。结果平均相对百分含量为12.45%，RSD为2.04%(n=6)。

3 讨论

当归的多糖含量较高，作为免疫调节剂和抗放射损伤剂，多糖已应用于临床，但多以粗多糖的形式被利用，质量难以控制，药效重复性差，不符合国际规范。当归在我国属于大宗药材，产地多，有野生的，也有种植的，种植技术、采收时间等也有差异，这些因素导致当归有效物质存在差异。在以当归多糖作为药用成分应用时，如何分离、提取和高效快速检测当归多糖是当归药材质量控制要解决的重大问题。超声提取-分光光度法是先用80%乙醇提取，以除去单糖、低聚糖、苷类及生物碱等成分，再用超声水提取多糖成分;多糖类成分在硫酸的作用下，先水解成单糖分子并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚合成有色化合物，用比色法测定其含量。超声提取方法缩短了提取时间，简便快捷，具有分离效果好、灵敏准确、重现性好等优点，且含量测定显色稳定，多糖水解较完全，故本研究采用此法测定当归多糖的含量。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:89-174.

[2]南换杰，秦雪梅，武 滨，等.潞党参多糖的超声提取和含量测定[J].山西医科大学学报，2008，39(7):641-643.

[3]刘 云.当归多糖的提取及含量测定[J].现代中药研究与实践，2003，17(1):49，53.

[4]胡小平，李玉云，李先何，等.当归多糖的成分及药理学研究新进展[J].中药材，2004，27(1):70-72.