诱导性多潜能干细胞（iPS）的应用进展

陈要臻，安群星，陈晓鹏，穆士杰，张献清，余瑞



诱导性多潜能干细胞（iPS）的应用进展

陈要臻，安群星，陈晓鹏，穆士杰，张献清，余瑞

710032 西安，第四军医大学西京医院输血科

诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）自问世以来，取得了突飞猛进的发展。2006 年 8 月，Takahashi 和 Yamanaka[1]确定诱导 iPS 细胞生成的 4 种转录因子是：Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4。2007 年 11 ~12 月，日本的 Yamanaka 小组用这 4 种转录因子组合将人的体细胞重编程为 iPS 细胞[2]。美国的 Thomson 小组用 Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28 这 4 种转录因子也将人的体细胞重编程为 iPS 细胞[3]。由于iPS 细胞与胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）的生物学特性非常相似，又不涉及伦理道德问题，因此具有重要的临床应用潜能。iPS 细胞的未来是可以安全用于临床的治疗型干细胞，本文就iPS 细胞临床应用的安全性与应用进展做一综述，并探讨其应用前景。

1 iPS 细胞的安全性

由于iPS 细胞有重要的临床应用潜能，因此将 iPS 细胞用于临床治疗前，要严格分析它的安全性。由于 c-Myc 是致癌基因，且 Klf4 也有一定的致癌能力[4-5]。为了提高iPS 细胞的安全性，科学家们做了很多研究，总结起来，主要有以下几点：

⑴避免使用致癌基因。Wernig 等[6]和 Nakagawa 等[7]不用 c-Myc 因子，只用 Oct4、Sox2 和 Klf4 这 3 个转录因子来诱导 iPS 细胞，并获得了成功。Feng 等[8]用 Essrb 替代 c-Myc 和 Klf4 这两个因子，与 Oct4 和 Sox2 共同作用把胎鼠成纤维细胞重编程为 iPS 细胞。组蛋白去乙酰化酶抑制剂 VPA 与 Oct4 和 Sox2 两个因子也可把人的成纤维细胞诱导成 iPS 细胞[9]。Thomson 小组[3]用Oct-4、Sox2、Nanog 和 Lin28 诱导人的成纤维细胞为 iPS 细胞也可以避开c-Myc 和 Klf4 的致癌性。

⑵利用某些体细胞中表达的内源因子，减少转录因子的使用数目。比如神经干细胞（neural stem cells，NSCs）和神经前体细胞（neural progenitor cells，NPCs）可表达 Sox2 因子，只用 Oct4 和 Klf4 两个因子就可以诱导 NSCs 和 NPCs 形成 iPS 细胞[10-11]。Kim 等[12]还发现 NSCs 表达 Sox2 和 Klf4 两种因子只用 Oct4 一个因子就可以将成年小鼠的 NSCs 重编程为 iPS 细胞。

⑶将已整合的外源基因从 iPS 细胞的基因组中清除。使用基因编码技术使得外来基因两端存在特有标志，诱导成功后，“Cre”酶识别这种标志去除 iPS 细胞中的外源重编程因子以得到没有外源因子的 iPS 细胞[13-14]。但是，Cre 介导的外源因子切除后，载体的一段 DNA 还留在插入位点上。而piggyBac（PB）转座子系统可将外源 DNA 彻底清除，不会引起基因组 DNA 序列的任何变化[15]。用 PB 转座子介导表达 4 个 Yamanaka 因子诱导 iPS 细胞，然后在这些 iPS 细胞中瞬时表达转座酶以切除外源 Yamanaka 因子。与“Cre”比较而言，PB 转座子系统是一种更安全的方法。

⑷小分子化合物替代转录因子。不仅外源基因有致癌的安全隐患，用于介导外源基因表达的逆转录病毒或慢病毒也有潜在的安全问题。不管是逆转录病毒，还是慢病毒，都会把外源基因整合到基因组 DNA 中，这就有可能引起插入突变。为了减少或避免插入突变，有的实验室进行了小分子化合物的筛选，希望找到可替代这 4 个重编程因子的小分子化合物。组蛋白甲基转移酶G9a 的抑制剂 BIX-01294 最早被发现可替代 Oct4，与其余的 3 个 Yamanaka 因子一起诱导 NPCs 形成 iPS 细胞[16]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂 VPA 与前面已经提到 Essrb 均可替代 c-Myc 和 Klf4 这两个因子。

⑸利用腺病毒介导。为了完全避免整合性病毒或转座子的使用，只在体细胞中瞬时表达 Yamanaka 因子以诱导 iPS 细胞的形成。Stadtfeld 等[17]尝试用腺病毒（不整合入基因组 DNA）来介导 Yamanaka 因子的表达来诱导 iPS 细胞。尽管他们成功获得了 iPS 细胞，并且没有外源基因的插入，但诱导 iPS 细胞的效率很低。

⑹利用脂质体介导。Okita 等[18]采用脂质体介导的转染方法来诱导 iPS 细胞。但是由于 iPS 细胞的形成大约需 10 -12 d 持续表达 Yamanaka 因子[19]，因此这种方法要求反复转染细胞以保证 Yamanaka 因子在重编程的前期持续表达，同腺病毒介导的方法一样，诱导 iPS 细胞的效率很低。Yu 等[20]将Yamanaka 基因添加到质粒的 DNA 环中（质粒通常存在于细胞的染色体之外），然后用核转染的方法将这些质粒介入到人包皮细胞中。在质粒中的基因所表达的蛋白质会将细胞重新编程并使其成为 iPS 细胞。这些 iPS 细胞在接着的几轮细胞分裂中会开始失去这些质粒，这样就可以分离出不含质粒的 iPS 细胞。

⑺直接导入重编程因子的蛋白，来诱导 iPS 细胞的形成。在重编程因子蛋白上连接细胞穿膜肽（cell-penetrating peptide），这样的融合蛋白可穿透细胞膜进入细胞内部，执行其重编程的功能。蛋白诱导的小鼠和人 iPS 细胞都已实验成功[21-22]，但是诱导 iPS 细胞的效率很低，而且蛋白容易失活。因为蛋白直接诱导 iPS 细胞在重编程过程中不会涉及任何的遗传修饰，所以，从 iPS 细胞临床应用的安全角度来看，它是目前最安全的方法，但是需要进一步提高其诱导效率。

⑻寻找安全性较高的 iPS 供体细胞。研究表明 iPS 细胞的供体细胞对于肿瘤形成有不同敏感性。Aoi 等[23]比较不同来源的 iPS 小鼠后代的成瘤趋势和死亡率，发现由 MEF 细胞衍生得到的 iPS 小鼠的成瘤趋势比从肝脏细胞和胃表皮细胞诱导得到的 iPS 细胞形成的小鼠要高很多，且前者的死亡率更高，存活时间短。Miura 等[24]利用小鼠胚胎的皮肤细胞、成年小鼠的胃细胞、尾巴的皮肤细胞以及肝脏细胞培育出的 36 种 iPS 细胞移植后使实验鼠出现肿瘤的危险性存在很大差异。结果显示，被植入分化细胞来自成年小鼠尾巴皮肤细胞的实验鼠中有 83%体内出现了肿瘤；被植入分化细胞来自于小鼠胚胎皮肤细胞的实验鼠中只有 8%出现肿瘤；而如果实验鼠移植的分化细胞来自成年小鼠的胃细胞，其体内没有出现肿瘤。上述研究表明选择何种体细胞作为培育 iPS 细胞的原料是非常重要的。

总之，iPS 细胞应用于临床之前，其安全性需要进一步的评价和提高，虽然很多研究都在这方面努力，但是彻底解决 iPS 细胞的安全性问题尚需时日。

2 iPS 细胞的应用性

成功建立 iPS 细胞后，应用 iPS 细胞来治疗疾病是人们的最终目标。iPS细胞不仅可用于分化和移植，还可以提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法。

⑴iPS 细胞的分化和移植在治疗血液疾病中显示了很大的用途。Xu 等[25]将 iPS 细胞诱导分化为内皮前体细胞，然后移植到患有血友病小鼠的肝脏中，使病鼠出血不止的症状得到了有效地改善。Hanna 等[26]将患病小鼠尾尖成纤维细胞重编程为 iPS 细胞，然后通过同源重组的方法用人野生型 βA-珠蛋白基因替代了 βS-珠蛋白基因，接着把遗传修饰后的 iPS 细胞定向分化为造血祖细胞（HPs），并将纯化后的 HPs 移植入 hβS/hβS 雄性小鼠中，HPs 有效地抑制了镰刀形红细胞贫血症症状。Raya 等[27]获得了基因修饰后的贫血症患者特异性iPS 细胞，这些 iPS 细胞能够分化形成表型正常的髓系和红系的造血祖细胞。中内启光等研究人员在培养 iPS 细胞时，添加人类骨髓细胞以及促进细胞增殖的蛋白质等物质，结果 iPS 细胞分化成了血小板的前身巨核细胞，巨核细胞进一步分化成血小板。从技术上来说，用 iPS 细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的[28]。红细胞体外培育的成功为人类研究通用红细胞提供了新的契机。笔者所在研究组正在努力用一 O 型 Rh 阴性个体体细胞重编程为 iPS 细胞，进而对该 iPS 细胞进行体外定向诱导分化，培育出通用红细胞。Lu 等[29]已建立了一个从人 ES 细胞高效地分化成红细胞的系统。如果将该系统应用于患者特异性 iPS 细胞上，就可获得无限量的患者自身的红细胞，这对于治疗一些血液疾病以及为罕见血型患者提供血细胞有着重要意义。

⑵iPS 细胞还可治疗神经系统疾病。Wernig 等[30]将 iPS 细胞分化为神经前体细胞，然后把这些细胞移植入胎鼠脑中，它们可整合到受体鼠的脑中，13.5 d 后形成神经胶质细胞和神经元细胞，包括谷氨酰胺能神经元、GABA 能神经元、儿茶酚胺能神经元细胞。将由小鼠 iPS 细胞在体外诱导分化来的多巴胺能神经元移植进帕金森病大鼠模型脑内，一段时间后可有效缓解大鼠疾病症状和改善其行为。最近，利用帕金森症患者的皮肤细胞培育出iPS 细胞后，又成功将其分化为多巴胺神经元细胞，这是帕金森症患者大脑中所缺少的一种重要细胞[31]。因此，其有望成为治疗帕金森症的一种方法。

⑶iPS 细胞也有望应用于治疗不孕症。Park 等[32]将人 iPS 细胞体外分化并分离得到原始生殖细胞（PGCs）。PGCs 在基因表达上与体内分离的 PGCs 极为相似。如果能够进一步将这些 PGCs 分化为精子和卵子，就可帮助患者解决不孕问题。

⑷来源于耳蜗毛细胞的iPS 细胞成功用于治疗神经感觉性听力障碍[33]。iPS 细胞在体外还成功定向分化了多种细胞，例如胰腺细胞和肝细胞[34]、分泌胰岛素的 β 细胞[35]、血管内皮细胞、淋巴内皮细胞和心肌细胞[36]。

⑸提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法。Dimos 等[37]和Ebert等[38]分别建立了肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩（SMA）患者特异性 iPS 细胞。通过定向诱导分化，将患者特异性的 iPS 细胞成功分化成了运动神经元。这些由患者来源的 iPS 细胞分化等的运动神经元为人们提供了一个体外研究 ALS 和 SMA 疾病的系统。在研究清楚了 ALS 和 SMA患者运动神经元的致病机制后，还可在患者特异的 iPS 细胞中通过遗传修饰来纠正基因缺陷，再分化得到功能正常的运动神经元，以进行移植治疗。此外，Park 等[39]和 Soldner等[14]建立了多种遗传病患者特异性的 iPS 细胞系，包括帕金森病、亨廷顿病、唐氏综合征/三染色体 21 等。Loh 等[40]成功地以人血液细胞为体细胞供体，诱导出了 iPS 细胞，使得构建一些病症突变只局限于血液细胞的患者特异性 iPS 细胞成为可能。利用从罕见神经系统疾病患者身上产生的干细胞，科学家们正在解析该种疾病的发病机制，并以此来测试若干候选药物的疗效[41]。从家族性植物神经功能不全症（FD，有一个基因突变，该基因对 IKAP 的蛋白进行编码，基因突变导致基因被转译成蛋白时部分基因序列被跳过）患者身上获取皮肤细胞，创建出 iPS 细胞系，诱导为特定的细胞类型，如神经嵴细胞（它能产生受 FD 影响的神经元）。这些细胞在分化成神经元的能力上是具有缺陷的，其并不像培养皿中的正常细胞一样容易迁移。研究人员利用此种差异来衡量 3 种药物的疗效，这几种药已被提议作为治疗 FD 的候选药物，其中一种药物就是激动素[41]。

这些患者特异性 iPS 细胞令体外研究病变的人体组织的形成成为可能，从而有助于探索疾病形成机制以及研发特异性新药。这些研究成果还表明将来有可能为患者量身定做各种细胞，进行个性化治疗。但是由于对干细胞（包括 iPS 细胞、ES 细胞和成体干细胞）自我更新与分化等行为的调控机制知之甚少，目前人们还不能按照自己的意图将干细胞在体外定向诱导分化为所需要的任何的功能细胞。随着人类对干细胞分化调控机制认识的不断加深，从人 iPS 细胞将会衍生出更多种类的人类细胞，将为细胞替代治疗新药筛选与评价及其他用途提供大量的细胞。

3 小结与展望

由于 iPS 细胞自身的安全性问题，目前 iPS细胞还无法应用于临床治疗。要得到安全实用的有临床应用价值的治疗型 iPS 细胞，我们必须避免使用整合性病毒以及有致癌性的外源基因。根据 iPS 细胞在短时间内取得的一系列突破，可以预见，iPS 细胞必将解决人类面临的各种疾患。目前，还面临许多急待突破的瓶颈和需要深入研究的领域：①研究 iPS 细胞自我复制、增殖和分化等的调控机制及 iPS 细胞体外定向诱导分化机制；②充分评价 iPS 细胞临床应用的安全性；③建立无遗传修饰的 iPS 细胞制备方法（如仅利用蛋白或小分子化合物即将人的细胞重编程为 iPS 细胞）。

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安群星，Email：bestar@fmmu.edu.cn

2009-12-29

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.013