奶牛布鲁氏菌病的检测技术研究进展

杨建伟,曹维伟

(山东省寿光市畜牧兽医管理局,山东寿光262700)

由布鲁氏菌属细菌引起的奶牛布鲁氏菌病是以感染家畜为主的人兽共患的传染病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。奶牛布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患的接触性传染病。主要侵害奶牛生殖道,引起子宫、胎膜、关节、睾丸及附睾的炎症;母牛临床发生胎衣停滞、流产及繁殖障碍。在人会引起发热,盗汗,无力,关节、头和全身疼痛[1]。奶牛布鲁氏菌病检测方法很多,几乎所有的细菌学检测方法在布病的检测中都有过应用和研究,而且随着血清学实验技术和生物工程技术的发展,奶牛布鲁氏菌病检测技术的研究也取得了新的进展,现对近些年来奶牛布鲁氏菌病的检测技术研究作一概述,供同行参考。

1 病原学检测

布氏菌属的细菌是一组微小的球杆状的革兰氏阴性菌。宽0.3～ 0.6 μ,长0.6～1.5 μ。无芽胞 、无鞭毛、不形成荚膜。姬姆萨染色呈紫红色,柯兹罗夫染色呈红色,其他菌为绿色。布氏菌生长繁殖对营养要求较高,生长缓慢,分裂一次时间约132～227 min。尤其初代分离的野生株生长更慢,通常需5～7 d,有的甚至需20～30 d才可生长出可见的菌落。生长最适温度为37℃,个别种型初代生长需一定浓度CO2。对所有流产奶牛都应怀疑是布鲁氏菌病并要进行调查,临床症状不具特征性,而畜群史对诊断有帮助[2]。把胎盘子叶、阴道排泄物和胎儿肺、肝和皱胃内容物进行涂片,加热或酒精固定后,用改良的萋——尼氏、科斯特氏、革兰氏或麦基亚维罗氏方法染色,或用荧光素或过氧化物酶标记的抗体结合物染色。细胞内出现大量堆积物,弱抗酸性布氏杆菌形态细菌或具有免疫特性着色的细菌,则可判定为布氏杆菌病。鉴于其他病原可能具有相似形态(如贝氏科可氏体、衣原体)或免疫学交叉反应性(如耶尔森氏菌属),因此解释结果时应谨慎[1]。

2 血清学试验

2.1 虎红平板凝集试验(RBPT)

一种非常简单的血清学试验,只需在洁净的玻璃板上取被检血清0.03 mL与抗原0.03 mL混合,4 min内判定结果,凡出现“+”以上凝集者均为阳性,出现阳性反应的动物应根据情况进行试管凝集试验或其他辅助诊断试验。

2.2 试管凝集试验(SAT)

我国布病诊断的法定试验。该试验在试管内进行。被检血清用0.5%苯酚生理盐水作12.5、25、50、100、200 倍稀释,置于小试管中各 0.5 mL,将抗原用0.5%苯酚生理盐水作1∶20稀释,加入上述各管血清中0.5 mL,同时设阴、阳血清对照充分混合后置36～37℃温箱中24 h,取出静止15～20 min判定。血清1∶100凝集“++”以上为阳性,1∶50凝集“++”为可疑。

2.3 布病补体结合试验(CFT)

一种特异性较高的血清学试验,通常被检动物群体经过虎红平板凝集试验检查后若出现可疑反应动物,就需用SAT或CFT做进一步确诊。该试验是将被检血清作成1∶10稀释,加入2管中每管0.5 mL,再向其中1管加入0.5 mL工作浓度的抗原,此管为试验管;另1管加0.5 mL生理盐水作为对照管,然后各加0.5 mL的补体混匀,置于37℃水浴20 min,取出观察结果0%～40%溶血为阳性,50%～90%溶血为可疑,100%溶血为阴性。注意稀释后的抗原必须当天用完。

以上三种诊断方法注意事项:试验温度应在25～30℃条件下进行;所用器材一定要清洁,血清和抗原用量很少,必须用量精确;被检血清自采血之日起不能超过15天,血清不能凝固腐败[3]。

2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)

目前市面上可以获得几种商品化的用不同抗原制剂,抗球蛋白酶结合物和底物显色剂的多种间接ELISA试剂盒,如北京天之泰生物科技有限公司的血清ELISA试剂盒及武汉华美生物工程有限公司的牛布鲁氏杆菌IgG抗体ELISA试剂盒等。这些方法通过广泛的田间试验已得到确认,而且正被广泛使用。间接ELISA高度敏感,但不能鉴别流产布氏杆菌19号免疫接种产生的抗体和病原菌株诱导产生的抗体。因此,在检测免疫接种过的牛时更应将间接ELISA当作一种筛选方法而不是确认的方法[4]。采用流产布氏杆菌OPS表位之一的特异单克隆抗体所作的竞争ELISA较间接ELISA特异性更高[5～7]。竞争ELISA可以排除绝大多数流产布氏杆菌19株免疫接种产生的残留抗体的反应。如市面上的北京天之泰生物科技有限公司的竞争ELISA试剂盒,鉴别免疫动物与自然感染动物,敏感性98%～100%,特异性99.7%～100%。

2.5 荧光偏振试验(FPA)

文献称荧光偏振试验(FPA)仍有前景。或许在合适的条件下该法适于应用。这种方法是检测抗原/抗体相互作用的一种简便技术,在实验室或田间都可操作使用。本法属同源性分析,分析物不需进行分离,因而该法快捷。试验步骤如下:①10 mm×75 mm硼硅玻璃管中加1 mL PBSAL缓冲液。管中加10 mL血清或20 mLEDTA处理的血液,在荧光偏振分析仪上读取光分布值。②以产生荧光强度250×103～300×103的抗原加到管中,混匀。每一批次都不同,但通常总在10 uL的范围。室温下孵育2 min后在荧光偏振分析仪上读取第二个数值。③高于临界值的读数判为阳性反应。④每批试验中都应包括:强阳性、弱阳性和阴性工作标准的血清(用OIE标准血清校准过)。荧光偏振试验诊断牛布氏杆菌的特异性和敏感性几乎与竞争ELISA相同。诊断新近免疫过流产布氏杆菌19株的牛的特异性大于99%[8]。

3 聚合酶链反应方法(PCR)

PCR是近来发展成熟起来的一种体外基因扩增技术,能在数小时内使DNA呈指数增加,已成功地用于多种细菌疾病的基因检测和分子流行病学调查等。其检测原理为:寻找传染性因子的特异DNA序列,对待测样品进行PCR扩增。如果检测出了相应的扩增带,则判为阳性反应;反之,无扩增带则为阴性反应。在布病研究中,采用PCR技术检查布氏菌始见于1990年。在国际上,于1995年和1996年将PCR技术用于布病的诊断探索。在国内,1995年中国疾病预防控制中心传染病预防控制所开始这方面的研究,1997年首次将PCR应用于布病病人的诊断。目前,各国各实验室所报道的结果极不一致,差异很大[9]。用PCR技术检测布氏菌的特异性和敏感性研究已经报道很多。用PCR来检测奶牛布鲁氏菌病在病的早期、快速、微量等病原学诊断方面具有目前常规的血清学检测及细菌培养无可比拟的优越性。市面上已有的PCR快速诊断试剂盒如长沙安迪生物有限公司的奶牛布鲁氏菌病的PCR快速诊断试剂盒等反应良好。

4 胶体金检测技术

胶体金标记检测技术是近年来发展起来的新技术,已广泛应用于病毒、细菌及寄生虫病的免疫诊断方面。此方法检测奶牛布鲁氏菌病与其他方法比较。ELISA方法虽具有敏感性高、特异性强等优点,但操作繁琐、耗时多,需要一定的仪器,在基层推广受到一定限制;PCR技术用于布病的诊断,因敏感性差,有待提高;试管凝集试验(SAT)虽是一种经典布病免疫诊断方法,具有较高的敏感性和特异性,但其操作步骤比较复杂,使用器械多,血清用量大,检测时间长,需花费较多的人力和物力;胶体金标记检测技术具有敏感性强,特异性高优点,且操作简便,不需任何仪器,血清用量少,检测速度快,更适合于布鲁氏菌病的诊断、流行病学调查及现场应用,为布病的检测提供一种新的手段[10]。目前市面上已有布病胶体金检测试纸条销售,但价格还比较昂贵。

5 其他方法

5.1 全乳间接ELISA

筛查奶牛群的一个极其有效的方法是检测大罐乳。这种来源的乳样比血样既便宜又容易多次采集。当检验出阳性后,所有供奶的牛都应作血液检测。全乳间接ELISA是最敏感和最特异的方法,尤其在检测大群牛时更有价值。若作ELISA不方便,全乳环状试验(M RT)是一种合适的选样方法。也可用间接ELISA检测个体动物[11]。如同血清间接ELISA,有多种全乳间接ELISA可采用,有几种商品化的间接ELISA试剂盒,已在广泛的田间试验中得到验证,且正在广泛应用。如北京天之泰生物科技有限公司的奶样ELISA试剂盒及武汉华美生物工程有限公司的牛布鲁氏杆菌IgG抗体ELISA试剂盒等。

5.2 全乳环状试验(MRT)

对泌乳动物,全乳环状试验可用来筛查牛群的布氏杆菌病。对大群牛(多于100头泌乳牛),本试验的敏感性会降低其可靠性。对新近免疫的牛(免疫后不超过4个月),或者对含有异常乳(如初乳或因患乳房炎而产生的异常乳)的样品,可能会发生假阳性反应。试验时将1滴30 uL标准牛种布氏杆菌全乳环状试验抗原加到已在4℃保存24 h以上的1 mL全乳中,试管中乳样高度至少25 mm以上。乳样品不应冻结、加热或剧烈振荡。全乳-抗原混合物与阳性和阴性对照一同在37℃作用1 h,不过,于4℃过夜孵育可增加试验的敏感性,试验容易判读。当乳柱顶部形成一个深蓝色环时,则判为强阳性。对于乳和乳脂层界面出现蓝色层,应视作阳性。如果下部乳的颜色超过乳脂层的颜色,则判为阴性[12]。

5.3 布鲁氏菌素皮肤试验

取0.1 mL布氏杆菌素,在尾褶、肋腹部或颈侧部皮内注射,48～72 h判定试验结果。局部肿胀变硬为阳性反应。建议在注射前,应用Vernier卡尺测量注射部位皮肤厚度,并于48～72 h后再检查,强反应易辨认,但弱反应需要细心判断[13]。尽管布氏杆菌素皮下试验是布病诊断中最为特异的一种方法,不应单独依据畜群中少数动物出现阳性皮内反应而作出诊断,而应有可靠的血清学试验如ELISA进一步证实。

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