RGD肽作为药物靶向配体的研究进展

安莲效，李 慧，顾月清

（中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏 南京 210009）

RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，广泛存在于生物体内，是整合素（Integrin）与其配体蛋白相互作用的识别位点。自Pierschbacher等于1984年首次报道纤维蛋白原中所含的RGD序列为细胞识别位点以来，RGD肽及其衍生物就成为众多学者关注与研究的热点。人体中最常见的含RGD序列的基质蛋白主要有纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、玻璃黏连蛋白、胶原、凝血栓蛋白等[1]。本文仅对近年来RGD肽在肿瘤诊断与治疗领域的研究进展作一综述。

1 RGD肽衍生物与整合素家族

整合素家族是一个由许多结构和功能相似的蛋白质所组成的膜受体家族，每个成员的分子都是由α、β两条链（亚基）通过非共价键连接形成的跨膜异二聚体糖蛋白，是细胞表面重要的兼具黏附和信号传导功能的受体[2]。现已经发现了由18种α亚基和8种β亚基[3]构成的24种整合素，α和β亚基共同决定整合素的受体特异性。整合素通过胞外域与细胞外基质（extracellularmatix，ECM），胞内段与细胞骨架、信号转导分子和其他一些蛋白相结合，介导细胞内外之间的双向信号传递[4]。一方面，细胞内信号通过整合素传导，使其活化，从而调节整合素与细胞外配体的亲和力；另一方面，整合素与配体结合后把胞外信号传入细胞内，导致细胞骨架重组、基因表达和细胞分化等。整合素在细胞的黏附、增殖、分化、转移、凋亡等过程中起着重要的调控作用，在肿瘤的侵袭转移中发挥着重要作用，αvβ3就是其中的一种重要分子。研究表明，整合素αvβ3在骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤等多种实体肿瘤细胞表面有高水平的表达[5]。

基于基质蛋白中RGD三肽序列能与整合素αvβ3特异结合[6]，研究者们合成了大量含RGD序列的线形或环形多肽作为整合素αvβ3的拮抗剂。对αvβ3拮抗多肽的构效关系研究发现，大多数线性RGD肽在体内循环过程中半衰期较短，对αvβ3受体亲和力较低，如GRGDSPK阻断玻璃黏连蛋白对αvβ3受体结合的 IC50仅为 1.2 μ mol/L，且易被蛋白酶降解，其生物活性亦不够理想。含有2个二硫键的环形RGD多肽对肿瘤新生血管内皮细胞的抑制效力最强，是含单一二硫键环形RGD多肽的20倍，是线形RGD多肽的100倍。环形RGD多肽由于多价态可以同时和几个αvβ3结合，因此较线形RGD多肽有更高的受体结合特异性[7]。此外，通过形成均多聚体或杂多聚体也可提高RGD肽对整合素受体的结合率和选择性。均多聚体可通过协同作用和对内源性配体的屏蔽作用从而提高其靶向亲和性能；杂多聚体则可结合于靶细胞中不同的受体，而提高其在靶组织中的摄取率。

2 RGD肽与肿瘤定位及诊断

2.1 RGD肽介导的放射性核素成像

随着生长抑素受体显像剂在临床上的应用，肿瘤受体显像越来越受到重视。αvβ3整合素在多种肿瘤细胞表面和新生血管内皮细胞上有高表达，而在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常器官系统中αvβ3不表达或者少量表达[8]。目前，在各种临床前肿瘤模型中运用RGD肽对αvβ3整合素的非侵入性成像已被深入研究。因此，可以设计含有RGD序列的多肽，并以放射性核素如125I，131I，111In ，99mTc，68Ga，18F 等[9]标记，利用配体与受体结合具有高特异性、高选择性及高亲和性的特点，使之与特定恶性肿瘤细胞上的整合素受体结合，从而使肿瘤部位得以显像，将是一类具有潜在临床应用价值的肿瘤受体显像剂。

Liu等[10]设计了两种通过PEG4连接、用18F标记的RGD环肽：18F-PEG4-c（RGDfk）2及18F-PEG4-E[PEG4-c（R GDfk）]2，实验证实在胶质细胞瘤模型中两个R GD基团用PEG4连接之后的18F-PEG4-E[PEG4-c（RGDfk）]2比单体能更好地与αvβ3整合素结合，在肿瘤部位信号摄取明显增强，相对于肌肉、肠及肺的靶与非靶放射性（T/NT）比值明显增加。用18F-PEG4-E[PEG4-c（R GDfk）]2进行的小动物PET显像证实这种 R GD肽能特异性地与肿瘤新生血管系统中的αvβ3整合素结合，提供肿瘤新生血管表达的重要信息。由于该示踪剂与整合素具有高亲和性和特异性及在体内代谢过程中具有的良好稳定性，使其在监测肿瘤血管发生与抗血管生成治疗中的应用成为可能。Li等[11]用64Cu标记的两种RGD肽复合物：R GD肽四聚体和R GD肽八聚体，并在整合素αvβ3高表达的胶质细胞瘤动物模型中进行PET成像。他们先以谷氨酸为连接臂将RGD肽连接成聚合体，两种RGD肽聚合体再通过DOTA（一种螯合剂）进行64Cu标记，然后对无胸腺小鼠肿瘤模型进行小动物PET成像。结果显示，与R GD肽四聚体相比，R GD肽八聚体对整合素αvβ3有明显更高的亲和力与结合特异性，四聚体和八聚体的IC50分别为 35和 10 nmol/L。且64Cu-DOTARGD肽八聚体在肿瘤部位滞留时间延长，肿瘤部位呈高度摄取，显像过程中肿瘤清晰可见。这些研究结果表明，64Cu标记的RGD肽在体内具有很好的稳定性和较为理想的药代动力学过程，因此将是一个很有发展前景的αvβ3受体显像剂。

2.2 RGD肽介导的荧光染料光学成像

近红外光（700～1 000 nm）属于非离子性光源、在生物组织中穿透深度大，受生物组织本底影响少，能够在不损伤活体动物的情况下，穿透深层组织而产生信号响应，而对组织本身几乎没有影响，同时还可以避免同位素可能造成的放射性污染[12]。近红外染料在实际研究中常与一些靶向片段相连，形成特异性近红外荧光探针，不仅可以直接或间接监控目标分子的体内行为，还可用于肿瘤凋亡的近红外成像、近红外荧光免疫分析、高效毛细管电泳中生物活性物质荧光检测等方面[13]。将R GD肽与近红外荧光染料偶联，利用RGD肽对整合素αvβ3特异结合的性质将有可能实现特定恶性肿瘤的近红外成像，从而达到实时无损在位监测早期恶性肿瘤的目的。

Ye等[14]用A549细胞系筛选得到一系列亲和力较强的含RGD序列的多肽（单体和多元R GD衍生物），并以近红外荧光染料cypate进行标记，结果表明，八元RGD衍生物cypate-[（RGD）4-NH2]2在肿瘤细胞内的浓度明显高于其他衍生物，显示该显像剂具有良好的应用前景。Wu等[15]将近红外荧光染料与RGD环肽共价结合构建了两种RGD肽复合物：Cy7-c（RGDyK）和 Cy7-PEG-c（RGDyK），对整合素αvβ3阳性的胶质细胞瘤U87MG肿瘤模型进行体内成像。研究结果显示，在肿瘤细胞、血管内皮细胞等整合素αvβ3高表达的部位有更强的荧光信号，且注射4 h后有最大的T/TN比值。他们还发现，Cy7-c（RGDyK）在肿瘤部位比 Cy7-PEG-c（RGDyK）有更高的荧光强度。若同时注射阻断剂c（RGDyK），肿瘤组织几乎不显像，说明荧光染料Cy7标记的RGD肽通过受体介导从而实现对整合素αvβ3高表达的肿瘤进行实时在位成像。Chen等[16]将另一种近红外荧光染料Cy5.5与R GD肽偶联进行三维小动物成像，研究结果同样表明，RGD肽能与整合素αvβ3特异结合，可以应用于整合素表达的无损在位成像及抗整合素治疗的实时监测。

2.3 RGD肽介导的磁共振成像

磁共振成像（Magnatic resonance imaging，MRI）以其高分辨率及成像参数的多元性在分子影像的研究方面占有重要优势，对肿瘤的定位、定性、手术方案的制订及预后的估计都有重要的意义。但灵敏度不高是亟需解决的难题，寻找高亲和力的分子探针成为当前分子影像学领域研究的热点。在新生血管内皮细胞表面，整合素αvβ3呈上调状态，而在正常组织的血管含量极少[17]。而且这些增生活跃的内皮细胞表面直接与循环血液接触，更容易接近药物，是一种特别适合作为肿瘤血管生成分子显像的分子靶。因此可将RGD肽耦合磁共振造影剂如钆剂作为特异性靶向探针用于肿瘤血管生成的MR显像。

Zhang[18]等利用含RGD序列多肽和超小超顺磁性氧化铁（uhrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）耦合成一种新型的特异性探针R GD-USPIO，与USPIO单体相比，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）对RGD-USPIO的摄取明显增加，且这种增加能被未耦合的RGD竞争性抑制。使用1.5 T磁共振肿瘤血管生成的成像，尾静脉注射RGD-USPIO后，在整合素αvβ3高表达的HaCaT-ras-A-5RT3肿瘤部位和低表达的A431肿瘤部位，信号的区域分辨率非常明显。说明RGD-USPIO可以有效区分整合素αvβ3的表达程度的差异。Mulder[19]等应用含R GD序列多肽质粒和Gd3+耦合成探针，在6.3T的磁共振扫描仪下可以特异性的显示肿瘤新生血管，并利用激光共聚焦方法证实了探针结合的部位为表达整合素αvβ3的内皮细胞。因此，基于RGD肽与整合素αvβ3的高特异性结合性能，以RGD肽偶联磁共振造影剂形成的靶向性探针，从而可以实现对肿瘤血管显像。

3 RGD肽与肿瘤治疗

3.1 RGD肽介导的肿瘤细胞毒药物治疗

传统的治疗肿瘤的药物普遍存在对肿瘤组织选择性差，毒副作用大等缺点，如何设计出良好的药物传递系统成为近年来的研究热点。随着“肿瘤生长依赖肿瘤血管”学说的提出，肿瘤新生血管靶向受体药物成为一种新型的、颇有潜力的提高肿瘤疗效的途径。整合素αvβ3是理想的肿瘤靶向治疗靶点，其配体RGD肽可以携带效应分子特异地与其结合，从而抑制肿瘤生长和新生血管的形成。因此，利用RGD肽将细胞毒药物靶向至特定肿瘤部位，将是一项颇有应用前景的肿瘤靶向治疗技术。

Cao等[20]考察了3H标记的紫杉醇（3H-PTX）与3H标记的R GD肽偶联紫杉醇药物（3H-R GD2-PTX）在MDA-MB-435乳腺肿瘤模型中的生物分布、体内代谢等过程，发现3H-R GD2-PTX比3H-PTX在肿瘤部位摄取更多，滞留时间更长。在使用剂量相同的条件下，RGD2-PTX的治疗效果较PTX、RGD肽联合治疗效果更好。这些研究结果表明，RGD肽靶向的紫杉醇药物能更有效地选择性杀伤肿瘤部位的新生血管内皮细胞，抑制肿瘤的效果更好。这种靶向配体技术也同样适用于可以选择性杀伤肿瘤的其他化疗药物。Xiong等[21]考察了用RGD类似物（RGDm）修饰隐形脂质体（stabilized liposomes，SL）上载阿霉素（doxorubicin，DOX）后在肿瘤部位的积聚及向肿瘤细胞内传递的情况。通过流式细胞实验和激光共聚焦显微实验考察肿瘤细胞对SL包封的DOX（SL-DOX）及RGDm-SL包封的DOX（RGDm-SL-DOX）的结合及摄取情况。结果显示，与整合素αvβ3高表达的黑色素瘤细胞共同孵育后，与SL-DOX相比，细胞对RGDm-SL-DOX的结合及摄取均显著增加。这些结果表明，RGDm修饰的SL可作为特定药物的靶向载体通过受体介导的方式将细胞毒药物有效靶向至特定肿瘤部位。

3.2 RGD肽介导的肿瘤基因治疗

肿瘤的基因治疗是将一个治疗基因“捆绑”在载体（如经过人工改造的、不能传染、不能复制的病毒载体、脂质体或纳米粒）上，随后将这种载有治疗基因的载体感染肿瘤患者或肿瘤细胞，使治疗基因进入肿瘤细胞，进而摧毁肿瘤细胞。整合素在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用，在肿瘤诱导的新生血管组织中表达丰富的αvβ3对肿瘤血管的生成起重要作用[22]。将整合素αvβ3作为基因治疗的靶点，针对整合素亚基设计一段特异的反义寡核苷酸，并通过转基因载体将其转染入肿瘤细胞中，从而调节整合素αvβ3介导的生物学作用[23]。肿瘤的基因治疗目前还面临着诸多问题，其中如何进一步完善基因治疗的运载系统，使携带的基因具有更高的靶向性尤为突出。利用RGD肽与整合素αvβ3特异性结合的性质，可将 R GD肽与载体偶联构建靶向性腺病毒载体[24]，携带效应分子靶向性进入肿瘤，直接或间接抑制肿瘤生长和新生血管形成。

Witlox等[25]将含有RGD-4C序列插入溶瘤腺病毒CR Ad AdΔ 24中，在该病毒衣壳纤维蛋白中 knob结构域HI环处重组上一段RGD肽，重组的Ad5-△24RGD腺病毒对αvβ3和αvβ5整合素趋向性较强，将该腺病毒注射入瘤体内，结合肿瘤细胞表面高表达的整合素αvβ3受体，选择进入存在Rb（视网膜母细胞瘤）途径缺陷的鼠骨肉瘤肿瘤细胞中，利用腺病毒自身原位复制扩增溶解细胞的能力，溶解原发癌细胞或移植瘤细胞，从而为治疗表达αvβ3和αvβ5整合素的骨肉瘤、神经胶质瘤、卵巢瘤、胰腺癌等实体瘤提供一种可行方法。Yang等[26]构建了一种能够靶向至肿瘤新生血管的RGD肽修饰的阳离子脂质体（RGD-Lipo），并作为靶向耐药相关基因MDRI的siRNA输送载体。体外实验结果表明，RGD-Lipo细胞黏附能力显著增强，并可增加细胞内siRNA的转染效果，且使用RGD-Lipo-siRNA有利于提高耐药细胞对放化疗药物阿霉素的敏感度，并将可能应用于临床耐药肿瘤的治疗。此外，RGD肽还参与腺病毒结构的改造，从而提高腺病毒转染的效率和选择性。Okada等[27]将IL-12和Ad RGD偶联得到Ad RGD-IL-12与Ad RGD-TNF-α联合治疗小鼠黑色素细胞瘤，结果显示用很小的量就能达到更有效的肿瘤消退效果，而且无副作用。

4 RGD肽衍生物及其展望

RGD肽作为整合素及其配体相互作用的识别位点，在肿瘤诊断、治疗方面有着很好的应用前景。R GD肽能够直接诱导肿瘤细胞的凋亡，通过对其人工改造可以减少不良反应，有利于发挥抗肿瘤效应；放射性核素及近红外荧光染料标记的RGD短肽也将是一类很有应用前景的肿瘤显像剂。利用RGD肽与整合素αvβ3的特异结合，将治疗效应分子靶向性地导入肿瘤部位，可以有效地减少肿瘤治疗中对正常组织或器官的损害；此外，RGD肽还可用于腺病毒结构的改造，从而可以提高腺病毒转染的效率和选择性。要使RGD肽或蛋白在肿瘤治疗方面得到广泛应用，必须考虑其分子专一性，大多数细胞可产生几种不同的整合素，而个别整合素存在于许多细胞上，若对目标无合适选择性，用RGD化合物或蛋白治疗某种疾病可能影响其他身体系统[28]。因此筛选出亲和力更高的整合素配体，即含RGD的多肽是关键性的问题。随着噬菌体库技术的不断成熟以及新的筛选技术，相信含RGD肽是一类很有前景的肿瘤治疗药物，其在肿瘤诊断和治疗方面的应用也会更加深入。

笔者所在实验室致力于近红外成像技术在生物医学领域中的应用与研究，利用R GD肽对肿瘤细胞的靶向性，连接上摩尔吸收系数大，荧光量子产率高的近红外荧光染料形成整合素αvβ3受体特异性近红外荧光探针，通过实验室自行组装的近红外荧光成像系统，从而有可能实现对过量表达αvβ3整合素的肿瘤的实时、在位和无损早期诊断的目的。此外，基于R GD肽的药物靶向配体性能，将此探针修饰不同的药物载体，将有可能实现实时、在位监测药物载体在小动物体内的的组织分布、代谢过程以及抑制肿瘤生长状况等。

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