bFGF-PLGA缓释微球及其体外释药性能研究

武继民,汪鹏飞,李志宏,袁晓燕

(1.天津大学 材料科学与工程学院,天津 300072;2.军事医学科学院 卫生装备研究所,天津 300161)

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factors,bFGF)是一种具有广谱作用的促进组织或血管形成生长因子[1-2]。bFGF在细胞外基质(ECM)中是联结细胞行为的专一信号因子,在创伤愈合中起到促血管化的主要作用[3-4],因此bFGF及其制剂的相关应用研究一直是组织工程支架材料、再生医学、创伤治疗领域最活跃的课题之一。但是,bFGF作为一种碱性多肽[5],在体内扩散快、对热和酸敏感、易被蛋白酶分解、半衰期短(3～5 min),因此其生物学效应不能得到充分发挥。如何有效地发挥bFGF的生物学效应制约着bFGF的进一步体内应用研究,药剂学的缓释技术较好的解决了这个问题。通过微球包埋,使bFGF与外界的酶解环境相对隔离,能够在相当长的时间内缓释药物并使局部药物浓度维持在一个相当的水平。

本文研究筛选出较理想的乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为缓释载体,通过W1/O/W2溶剂挥发法(复乳法),对bFGF进行微纳米包埋,制成bFGF-PLGA缓释微球。并研究了其释药行为。

1 材 料

bFGF冻干粉剂(北京双鹭生物制药有限公司);PLGA(75/25,相对分子质量5.0万,山东医疗器械研究所);聚乙烯醇(PVA,纯度:96%～98%,水解度:98%,聚合度:1 750±50,中国医药集团上海化学试剂公司);bFGF ELISA试剂盒(双抗夹心96孔,ADL进口分装);二氯甲烷等试剂均为分析纯。

JSM-6700F型场发射扫描电镜(日本);X-520型高速匀浆机(美国);78-1型磁力加热搅拌器(江苏金坛市富华电器厂);CR22G型超速冷冻离心机(日本);Freezone 6型真空冷冻干燥机(美国);DH4000A型隔水式电热恒温培养箱(天津泰斯特医疗器械厂);SHA-CA型水浴恒温振荡器(江苏金坛市医疗仪器厂);MULTISKAN MK3全自动多功能酶标仪(美国)。

2 方 法

2.1 bFGF-PLGA微球的制备

采用溶剂挥发法制备包埋bFGF的PLGA微球。将水溶性的bFGF溶于生理盐水中作为内水相(W1),PLGA溶于二氯甲烷中作为油相(O),不同浓度、体积的PVA水溶液作为外水相(W2)。将内水相逐滴滴入油相中,以高速匀浆机在30 000 r/min下乳化1 min形成初乳(W1/O),待初乳稳定后,将初乳液滴入一定体积不同浓度的PVA水溶液中(W2),15 000 r/min下搅拌3min形成复乳(W1/O/W2)。然后将复乳液倒入烧杯中,磁力搅拌挥发3～5 h,过滤,3 500～5 000 r/min离心15～20 min,去离子水洗涤、过滤后再离心,如此反复操作3～5遍,直至将多余的PVA清除。将样品-20℃冷冻保存至少48 h;冷冻干燥24 h,收集微球粉末待用。

2.2 bFGF-PLGA微球表面形貌观察

将少量的微球粉末放在贴有双面胶的载玻片上,制成相应的扫描电镜样品,喷金后利用SEM观察微球表面形貌。

2.3 ELISA检测法及标准曲线的绘制

采用双抗体夹心ELISA法测试,利用抗人bFGF单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的bFGF与单抗结合,加入生物素化的抗人bFGF抗体(二抗),它将与结合在单抗上的人bFGF结合而形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与二抗的生物素结合,加入TMB显色。在450 nm波长处测定吸光度(A)值,bFGF浓度与A值成正比,可通过标准曲线求出样品中bFGF浓度。

作标准曲线时,要扣除标准品稀释液造成的本底;如果标本用标准品稀释液稀释,也要扣除标准品稀释液造成的本底,如果样品未用标准品稀释液稀释,不需扣除标准品稀释液造成的本底。以浓度分别为600,300,150,75,37.5,18.75,9.38,0 pg/mL标准品浓度为横坐标,以与之对应的A值为纵坐标,作图建立bFGF的标准曲线并得出标准方程。然后根据样品A值在该曲线图上查出bFGF浓度。

2.4 微球中bFGF的载药量和包封率测定

称取微球20mg,加入二氯甲烷2mL中,使其完全溶解,再加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)1mL,充分搅拌、静置、分液,收集水相冻存,ELISA法测定样品A值。根据样品A值及标准曲线计算待测液中bFGF的浓度,从而计算出测试微球中的bFGF含量。载药量=(微球中bFGF质量/微球总质量)×100%;包封率=(微球中 bFGF质量/投入bFGF总质量)×100%。

2.5 微球中bFGF的体外释放行为研究

称取微球50mg装入释放管中,以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)10mL为释放介质,于37℃振荡速度为100 r/min的水浴恒温振荡器中,分别在0.5,1,2,3,5,8,12,17,23,30,45 d取出释放介质2mL于离心管中标号冻存待测并及时加入同样体积的释放介质。

由标准曲线计算出微球中bFGF的释放量,并计算累积释放率,得到微球中bFGF的体外释放曲线。突释率为微球中药物在第1天的累积释放率。

3 结 果

3.1 微球的形态与粒径

经SEM观察,bFGF-PLGA微球表面光滑无孔隙,球形好;形态及粒径大小较均匀。如图1所示。微球粒径为(0.75±0.08)μm。

图1 bFGF-PLGA微球表观形貌SEM图Fig.1 SEM image of bFGF-PLGA microspheres

3.2 标准曲线的建立

进行线性回归得标准曲线方程:C=322.58 A-87.68,r2=0.919 9。

3.3 微球载药量、包封率及体外释药行为

5批次测定结果见表1。bFGF-PLGA缓释微球载药量和包封率平均值分别为(59.9×10-3)%和79.9%,微球的突释率均值为20.0%。微球在45 d内,能够持续释放bFGF,且释放浓度比较稳定。将上述5批试样混合后经检测,45 d微球中bFGF的累积释放率达80%。bFGF微球的体外释药曲线也显示,bFGF-PLGA缓释微球能够体外持续释药,具有明显的缓释作用(图2)。

表1 bFGF-PLGA缓释微球载药量、包封率和突释率Tab.1 Drug loading amount,encapsulation efficiency and initial burst release percentage of bFGF-PLGA microspheres

图2 bFGF-PLGA微球的体外释药曲线Fig.2 In vitro release profile of bFGF-PLGA microspheres

4 讨 论

bFGF作为一种广泛存在于人体各组织中但含量极微的生物活性物质,主要作用于中胚层组织与神经外胚层组织和细胞,能够促进多种细胞分裂增值,促进微血管分化,使局部毛细血管增加,改善血液循环,刺激骨细胞DNA合成和增值,增加骨细胞合成胶原和非胶原蛋白的能力,诱导胚胎发育[6]。因此,bFGF能够有效地促进骨、软骨、肌腱、皮肤、血管、韧带和中枢神经等多种组织的创伤修复;并且与肿瘤的生长、增殖及一些神经性系统疾病的发生具有密切联系[7]。

本研究制备的bFGF-PLGA缓释微球,使其在创伤初期修复阶段,持续在组织局部释放bFGF,并维持在有效生理浓度,以显著促进创伤组织修复。本研究以PLGA为载体材料,应用单因素设计+正交设计进行bFGF微球制备工艺优化,结果显示,bFGF-PLGA缓释微球表面光滑圆整,球体均匀性较好,微球冻干后呈疏松白色粉末,再分散性良好,可在常规条件下进行分装。

一般认为,缓释制剂在突释期内释放的药物量应占总量的20%左右,且药物释放曲线平滑,没有过大的波动[8]。本研究显示,微球的体外释药规律符合Higuichi方程,突释率均值为20.0%,45 d后累积释放量达到80%,且其浓度保持在一定的水平。因此,在45 d内bFGF微球体外缓释作用明显,并且释出bFGF浓度变化不大,实验结果比较理想。

总之,本研究所制备的bFGF-PLGA缓释微球有望发展成为一种具有对bFGF进行中长期缓释功能的药物载体,为研制符合临床治疗需要的中长效注射剂提供实验依据。同时,若bFGF-PLGA缓释微球引入支架材料,将有效促进血管化[9-10],在组织工程研究领域具有广阔的应用前景。

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