线栓法大鼠脑缺血再灌注模型改良与评价

吴远华 朱广旗 胡 蓉 仲秀艳 苏红梅 欧阳泠星 吴帮启 舒遵华 王 强

1)贵阳中医学院第一附属医院神经内科 贵阳 550002 2)山东临沂市人民医院中医科 临沂 276000 3)广东清远市人民医院中医科 清远 511500 4)天津中医药大学第一附属医院针灸科 天津 300193 5)长春中医药大学附属医院 长春 130021 6)湖北襄樊市中医院 襄樊 441000

本研究在实验过程中发现一改良线栓法制作MACO大鼠模型,成功率高,且无需借助显微镜即可进行操作,现将该方法介绍如下。

1 材料和方法

1.1实验动物60只健康,清洁级SD大鼠,雌雄各半,鼠龄3～4个月,体质量260～300 g,由贵阳医学院实验动物中心提供,饲以标准育成饲料,自由饮水。

1.2模型的制备见图1、2。

1.2.1 线栓头的制作:线栓头制作选择直径0.26 mm(3-0)市售尼龙鱼线,长4.0 cm,头端去棱角使之钝化,并距头端18、20 mm处分别作一标记,酒精清洁后置生理盐水中备用。

1.2.2 模型的制作:大鼠大脑中动脉梗死(MCAO)模型参照Zea Longa等报道的方法加以改进,即选用颈外动脉插入线栓法。具体方法如下:(1)大鼠以3%水合氯醛(1 mL/100 g体质量)腹腔注射麻醉。(2)颈前皮肤正中切口,暴露左侧颈三角。(3)分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。(4)用双极电凝器电凝ECA分支翼腭动脉(PPA),结扎、切断、游离ECA主干,在其根部用 1号线打一松结。(5)用缝合线暂时阻断CCA和ICA血流,在ECA残端剪一约相当于ECA直径2/3大小的切口,将制备好的栓线插入ICA(预先蘸有肝素钠),至阻断ICA血流处。(6)不完全结扎ECA根部丝线,去除暂时阻断ICA血流的缝合线,线栓从颈外动脉插入,进入颈内动脉颅内段,当遇有轻微阻力时停止,结扎ECA根部丝线,去除暂时阻断CCA血流的缝合线。(7)栓子插入19～22 mm,栓线经 ICA分叉轻插入颅内至大脑前动脉(ACA),该深度恰好堵塞MCA开口。(8)消毒、缝合皮肤。对照组:大鼠大脑中动脉梗死模型参照Zea Longa等报道的方法进行。

1.2.3 动物模型制作成功的标准:参照Zea Longa评定进行神经功能缺损程度的评价:0级,无缺陷;1级,不能伸展对侧前肢;2级,对侧前肢屈曲;3级,轻度向对侧转圈;4级,严重的转圈;5级,对侧瘫痪。3～4级为模型制作成功。

1.2.4 脑梗死体积的测定、评价模型稳定性:大鼠48 h存活率再灌 48 h,取脑,测量大脑长,切片,厚 2 mm,TTC染色;4%多聚甲醛固定24 h;照相,图像分析系统计算脑梗死体积,采用梗死率表示梗死体积(梗死率:梗死面积/总面积×100%=(S1+S2+S3+….SN)H/(S1总+S2+SN总)H,S表示每片的梗死体积,H表示每片厚度)。计算实验组与对照组大鼠脑梗死体积的变异系数(变异系数的计算公式:CV=s/¯x×100%,s表示标准差,¯x表示平均数,CV表示变异系数),比较2组大鼠脑梗死体积的稳定性。观察大鼠48 h存活率。

1.3统计学方法采用均数±标准差(s)表示,组间比较用独立t检验,计数资料使用χ2检验。脑梗死体积的稳定性用变异系数(coefficient of variation)表示。

2 结果

2.1模型成功率2组大鼠共60只,5只死于麻醉意外,实验组2只,对照组3只,被排除。实验组成功制作模型20只,失败6只,死亡2只,成功率71.43%。对照组成功21只,失败4只,死亡 2只,成功率 77.78%。2组大鼠模型成功率之间差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2神经功能缺失评分实验组模型中,10只大鼠神经功能评分达3级,3只 4级,3只 5级,4只在3级以下,神经功能评分在3～4级的大鼠所占比例为65.00%;对照组中,14只大鼠神经功能评分达3级,2只达4级,2只5级,3只在3级以下,神经功能评分在3～4级的大鼠所占比例为76.19%,2组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3脑梗死体积实验组脑梗死体积为(32.42±7.62)%,对照组为(35.52±5.79)%,上述各指标与传统的 Zea Longa线栓法模型相比差异无统计学意义(P＞0.05)。2组的模型稳定性相近,实验组脑梗死体积变异系数为23.50%,对照组变异系数为16.30%,2组脑梗死体积之间差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 48 h存活率实验组神经功能评分达4级的大鼠死亡7只,评分达3级的大鼠死亡1只,病死率40%;对照组大鼠中神经功能评分达4级的大鼠死亡9只,评分达3级的大鼠死亡2只,病死率52.38%。2组大鼠 48 h,存活率间差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

在临床脑血管病分类中,缺血性脑血管病占70%,而MCAO又占其中60%左右,因此对MCAO的研究在脑血管病研究中占有非常重要的地位。大鼠具有成本低、种系内纯合性好、脑血管解剖特性与人类相似等特点,因此到目前为止,大鼠仍为脑缺血研究最常用的实验动物。此外,大鼠尚具有较强抗感染能力和生命力,常规操作一般不会引起伤口继发性感染,且动物存活时间相对较长,这些特性也给研究带来了很大方便。近年来,国内外对大鼠MCAO模型进行了大量研究,除线栓法外,近年常用的有:(1)颈内动脉注射栓塞剂闭塞MCA法,此方法制作的栓子具有很大的随机性,往往不能准确地闭塞MCA。(2)经颞下或经眶入颅电凝或结扎MCA法,该法由于需要开颅,必然引起脑脊液外流,损伤脑组织,影响了缺血后脑水肿和颅内压病理变化的自然过程。(3)光化学诱导MCA血栓形成法,此法易引起微血管内皮损害及早期血脑屏障破坏,造成终末动脉闭塞,不同于大血管阻塞的自然病理过程。上述方法还有一个共同的缺点,即此类模型不能再灌流,不适合用于模拟人类脑梗死或溶栓药物治疗后血管再通方面的研究。

MCA线栓法是目前国内外广泛应用的一种方法,1986年Koizumi[1]首次采用不开颅经CCA栓入尼龙线致大脑中动脉闭塞获得成功,后经Zea Longa[2]对此法适当改进,而广泛用于实验性脑缺血研究。1993年 Garcia[3]和 Holland等[4]都采用Longa法制作 MCAO模型,结果认为 Longa法是成功的模型制作方法。另外,大量文献报道[5-7],在前人线栓法基础上进行部分改进,结果表明改进后的线栓法复制的可逆性局灶性脑缺血模型缩短了手术时间,简化了模型制作过程,提高了模型成功率。该方法被普遍地认为是局灶性脑缺血标准动物模型,具有不开颅、效果肯定且可以准确控制缺血及再灌注时间等优点,因此用其研究神经元对缺血的敏感性、耐受性以及再灌注损伤和治疗时间窗较为理想。同时该模型对动物本身的生理功能影响较小,动物存活时间长,也适用于慢性脑损伤的研究。值得注意的是,该模型实际上是机械性人工栓塞性卒中,与人群常见卒中发病过程存在差异,而且手术操作过程较为复杂,许多细节,如动物品系、体质量、栓子粗细以及插入深度是否得当等均会影响实验结果。因此,在实验过程中,综合以上线栓法制备大鼠M CAO模型,采用以下方法:(1)采用了SD大鼠,该大鼠MCAO模型产生的梗死灶恒定,变异较小[8],将大鼠的体质量控制在(280±20)g,体质量过大,颅内血管增粗,栓线难以完全阻断MCA血流;体质量过小,栓线则难以插入颅内;选用栓线的直径为0.26 mm,插入栓线的深度为19～22 mm。(2)大鼠以3%水合氯醛(1 mL/100 g体质量)腹腔注射麻醉,麻醉效果不好时,可少量追加,尽量减少不必要的麻醉死亡。(3)保持室温在25～30℃,在分离动脉过程中,注意保护沿着ECA、CCA走行的迷走神经,防止呼吸道分泌物过多。呼吸道分泌物过多时可适当吸痰,术后注意保温,这些措施可以提高动物的生存率。(4)另外还发现,Zea Longa等在大鼠清醒状态下将留在体外的尼龙线拔出以再通血流,大鼠清醒时,受拔线的刺激会用劲挣扎,引起蛛网膜下腔出血,大鼠病死率高,于是在给大鼠拔线再灌注时再次麻醉大鼠,降低了颅内出血率,使实验成功率大大提高。(5)不结扎翼腭动脉(PPA),提高再灌注成功率。有实验表明[9],结扎PPA,ICA内的栓线周围易形成血栓,致血管闭塞,再灌注时,难以保证正常的血供,且PPA不是基底节区侧支循环的主要供应血管,结扎与否,并不影响脑梗死体积和神经缺失症状。(6)栓线制作方法直接关系到模型成功与否及蛛网膜下腔出血发生率,栓线制作方法的改进主要是对栓线头端的处理。本实验采用头端去棱角钝化的方法制作栓线是模型改进的最重要步骤。目前使用的栓线头端的制作方法主要有以下几种:Koizumi[1]的方法是在栓线头端涂以硅树脂,但 Memezawa[10]认为该方法较难;Longa是把栓线的头端烧成球形;Belayev[11]的方法是先用火加热使栓线头端变钝,然后在头端涂以多聚赖氨酸溶液。Laing曾将Longa法和Koizumi法进行对比研究,发现Longa的方法成功率较低,且蛛网膜下腔出血发生率较高。以上方法制成的线栓头端直径大小不容易控制,导致线栓粗细不均,影响模型的效果。本实验使用头端去棱角钝化的方法制作栓线进行造模,较容易使线栓头端直径统一,实际操作发现SAH发生率低,因此本实验采用该种线栓处理方法造模。实验研究表明,改良后的大鼠MCAO模型在制作成功率为71.43%;神经功能缺失评分3～4级为 65.00%;实验组脑梗死体积为(32.42±7.62)%。上述各指标与传统的Zea Longa线栓法模型相比差异无统计学意义(P＞0.05)。2组的模型稳定性相近,实验组脑梗死体积变异系数为23.50%,对照组为16.30%,2组脑梗死体积之间差异无统计学意义(P＞0.05)。提示改良的大鼠MACO模型是一种稳定性好、可重复率高的大鼠脑缺血/再灌注模型。

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