治疗性人源抗狂犬病毒抗体研究进展

陈哲，孙丽娜，梁米芳

治疗性人源抗狂犬病毒抗体研究进展

陈哲，孙丽娜，梁米芳

狂犬病是由狂犬病毒（rabies virus，RV）引起的人兽共患疾病，发病后死亡率几乎达百分之百。狂犬病毒属弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus），基因组编码五种结构蛋白，其中由 G 基因编码的糖蛋白，是病毒与宿主细胞结合的配体，能诱导机体产生中和抗体，与病毒的毒力、致病性密切相关。根据世界卫生组织（WHO）推荐的狂犬病暴露后预防措施，对狂犬病三级暴露后的预防主要是采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋白（rabies immune globulin，RIG）的方法。目前使用的两类 RIG 为人抗狂犬病毒免疫球蛋白（human rabies immune globulin，HRIG）和马抗狂犬病毒免疫球蛋白（equine rabies immune globulin，ERIG）。但 ERIG 副反应比较严重，而且对某些疫苗的抗体反应有抑制；HRIG 价格昂贵，供应量有限并且有潜在的病原威胁。而抗狂犬病毒单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）具有中和效果高、安全性好、成本低、可大量生产等优点，能够取代 RIG 用于狂犬病的暴露后预防[1]。

1 狂犬病毒分子遗传特征

狂犬病毒基因组为不分节段的单股负链 RNA，全长约12 kb。基因组的 3’ 端至 5’ 端依次排列着 N、P、M、G 和L 共 5 个结构基因，各基因的序列长度分别为 1421、991、805、1675 和 6429 个核苷酸，分别编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和转录酶大蛋白（L）。每个基因均由 3’ 端非编码区、编码区和 5’ 端非编码区三部分组成。其中编码核蛋白的 N 基因是狂犬病毒属的主要基因分型依据。

根据不同毒株的免疫血清反应和抗狂犬病毒单克隆抗体的分析，可将狂犬病毒分成四个血清型：血清 I 型（狂犬病毒）、血清 II 型（Lagos 病毒）、血清 III 型（Mokola 病毒）、血清 IV 型（Duvenhage 病毒）。1993 年 Bourhy 等[2]根据核蛋白基因的 N 末端 500 个核苷酸的相似百分率，将狂犬病毒属分为 6 个基因型：其中基因 1 型到基因 4型与血清型分型相同，其余分型为基因 5 型（EBL1 病毒）、基因 6 型（EBL2 病毒）。1996 年 7 月，澳大利亚的 Gould等[3]发现果蝠体内的澳大利亚蝙蝠狂犬相关病毒（Australia bat virus，ABLV），被定为基因 7 型。2001 年，Knipe 等[4]对狂犬病毒基因分型进行比较研究认为 7 个基因型又可分为 2 个进化组：第一组包括基因型 1、4、5、6 和 7，第二组包括基因型 2 和 3。同组内一种病毒的抗体与其他病毒可产生交叉反应，不同组的病毒之间不能产生交叉免疫保护。2008 年，Delmas 等[5]利用狂犬病毒全基因组序列对7 个基因型包括 24 株狂犬相关病毒进行基因分析，分析结果肯定了 7 个基因型又可分为 2 个进化组的结论。我国尚未系统地对狂犬相关病毒进行研究，目前仅发现了基因 1型病毒。

2 狂犬病毒糖蛋白表位研究

狂犬病毒糖蛋白基因共编码 524 个氨基酸，前 19 个氨基酸构成疏水性的信号肽，糖蛋白前体切除 N 端的 19 个氨基酸残基后，在内质网中经糖基化等修饰成为成熟的糖蛋白。成熟的狂犬病毒糖蛋白是由 505 个氨基酸组成的多肽。糖蛋白以三聚体的形式位于狂犬病毒脂蛋白包膜上，长 8 ~ 10 nm，相对分子量约 65 ~ 70 kD。成熟的狂犬病毒糖蛋白分成三个区域：膜外区 1 ~ 439 位氨基酸，位于病毒颗粒包膜的表面，参与识别受体与膜融合反应，并携带有 B 细胞和T 细胞的抗原位点；跨膜区 440 ~ 461 位氨基酸，由 22 个氨基酸组成连续性疏水区，与糖蛋白在病毒双层脂膜上的固定有关；膜内区 462 ~ 505 位氨基酸，定位于病毒包膜的内表面，提供基质蛋白和核蛋白作用的位点。经比较发现，跨膜区和膜内区在不同地方狂犬病毒株中差异较大，氨基酸同源性在 50% ~ 60% 之间，膜外区的保守性略高一些，氨基酸同源性高于 90%[6]。

用对单克隆抗体逃逸株的点突变分析和单克隆抗体的中和试验研究糖蛋白上抗原的结合位点，发现糖蛋白上至少存在 3 个主要中和抗体结合位点：抗原位点 I、抗原位点II 和抗原位点 III。其中抗原位点 II 和抗原位点 III 是病毒与中和抗体结合的主要部位。抗原位点 II 比较保守，由第 34 ~ 42 位和第 198 ~ 200 位氨基酸残基两个表位通过二硫键连接形成，是一个典型的空间构型抗原位点[7]。其中34 ~ 42、147、184、198 ~ 200 位氨基酸至关重要[8]。抗原位点 III 位于 330 ~ 357 位，其中 333 ~ 338 位氨基酸区段是中和抗体主要结合部位，虽然是一段连续的氨基酸区段，但也是一个空间构型抗原位点，其中第 333、336 及 338 位氨基酸是最关键的氨基酸[9]。而位于 342 ~ 343 位氨基酸残基则是次要的中和位点[7]。抗原位点 III 的 333 位精氨酸与狂犬病毒毒力的丢失有着紧密关系。根据最近报道，抗原位点 I 位于 218 ~ 240 位氨基酸区域，是一个线性中和抗原表位，其最小结合区为 226 ~ 231 位的 KLCGVL，核心残基为 K-CGV-[10]。通过对抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体逃逸株的序列分析证明，只要 1 个氨基酸被替代，病毒便可逃避特异性单克隆抗体的中和[8]。

狂犬病毒糖蛋白是狂犬病毒的主要病毒抗原，它不仅介导病毒与细胞的结合，决定病毒的毒力，还是狂犬病毒所有蛋白中唯一能诱导宿主产生中和抗体的蛋白。因此，研究针对狂犬病毒糖蛋白的单克隆抗体，不仅能促进狂犬病毒的机制研究，还能应用于狂犬病毒的临床治疗。

3 狂犬病毒单克隆抗体研究

1975 年 B 淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术问世，1978 年，Wiktor 和 Koprowski[11]通过 B 淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术获得了抗狂犬病毒单克隆抗体，并证明能够保护动物抵抗致死性的狂犬病毒的攻击。1990 年，Dietzschold 等[12]获得了 9 种能够识别狂犬病毒糖蛋白、核蛋白和基质蛋白特异性抗原决定簇的单克隆抗体，但其中只有针对狂犬病毒糖蛋白的单克隆抗体 Mab57 能够中和多种狂犬病毒。2003 年，Prosniak 等[13]将 Mab57 通过基因重组并在弹状病毒载体中表达，命名 SO57。同年，Jones等[14]通过 PER.C6 系统对 SO57 进行改造，改名为 CR57。2007 年，Muhamuda 等[15]获得了多株鼠源单克隆抗体，并在动物保护实验中证明可以在一定程度上保护狂犬病毒的致死性攻击。

早期的杂交瘤单克隆抗体一般为鼠源单克隆抗体，鼠源单克隆抗体在人体中常不能有效地活化补体和 Fc 受体相关的效应，而且由于鼠源单克隆抗体是异源蛋白，在体内很快就被清除掉，并且容易产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA），从而削弱其治疗的有效性，这些推动了人源单克隆抗体的产生[16]。而噬菌体抗体库技术的出现，大量获得人源基因工程抗体成为可能。2001 年，Ray 等[17]利用噬菌体抗体库技术构建了人源抗狂犬病毒单链噬菌体抗体库。筛选获得了人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体。并有可能取代目前使用的人免疫球蛋白用于暴露后治疗。2005年，Kramer 等[18]构建了人源抗狂犬病毒单链噬菌体抗体库，并将获得的 147 种单链抗体中的 21 株改造成为全长人 IgG，其中一株单克隆抗体 CR4098 针对狂犬病毒糖蛋白 III 号位点并具有较高的亲和力。2007 年，Sloan 等[19]利用携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠获得了人源抗狂犬病毒单克隆抗体 17C7，17C7 针对狂犬病毒糖蛋白 III号位点并能保护仓鼠被动免疫后完全抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击。2009 年，Houimel 和 Dellagi[20]构建了人源抗狂犬病毒 Fab 噬菌体抗体库，并筛选获得了 6 株 Fab 抗体，其中 3 株特异性针对狂犬病毒糖蛋白 III 号位点并显示了一定的中和狂犬病毒 CVS-11 株的能力。目前，我国在人源抗狂犬病毒单克隆抗体上也取得了一定的进展，赵小玲等[21]通过核糖体展示技术构建了人源抗狂犬病毒单链核糖体抗体库，并获得了几株针对狂犬病毒并能特异性识别狂犬糖蛋白的单链抗体。由于狂犬病毒基因型别较多，糖蛋白的序列并不十分保守，使用针对单一中和抗原位点的单克隆抗体不能起到广谱、安全的疗效。如何将针对不同中和抗原位点的单克隆抗体联合起来使用，成为了治疗性狂犬病毒单克隆抗体面对的重任。

1989 年，Schumacher 等[22]制备了多株针对狂犬病毒糖蛋白、核蛋白的鼠源单克隆抗体，并将这些针对不同狂犬病毒蛋白的鼠源单克隆抗体混合使用称之为单克隆抗体鸡尾酒（cocktail of anti-rabies monoclonal antibodies，McAb-C），对动物的保护性实验表明：该方法不仅具有被动免疫后完全抵抗致死剂量狂犬病毒攻击的能力，还具有暴露后保护作用。2003 年，Prosniak 等[13]通过基因重组将 3 株针对不同抗原表位的中和性单克隆抗体在弹状病毒载体上表达，并将改造后的单克隆抗体混合在一起使用，并在小鼠攻毒试验中证明与 HRIG 的保护效果近似，在成本和安全性等方面优于 HRIG，可用于狂犬病的暴露后预防。2005 年，Goudsmit等[23]将针对狂犬病毒糖蛋白 I 号位点的中和抗体 CR57和针对狂犬病毒糖蛋白 III 号位点的中和抗体 CR4098 混合使用，中和了 26 种典型的街毒株。对动物的保护性实验表明，利用单克隆抗体鸡尾酒疗法进行治疗具有可行性和优越性。2008 年，由 Crucell 公司开发的 CR57 和 CR4098构成的单克隆抗体鸡尾酒 CL184 在美国和印度完成了I 期临床，该临床结果表明 CL184 安全有效，可取代 RIG，用于暴露后预防[24]。出于低成本的考虑，2009 年 Müller等[25]开发了一种由 5 种鼠源单克隆抗体（E559.9.14、1112-1、62-71-3、M727-5-1 和 M777-16-3）组成的鸡尾酒，希望能取代 HRIG 进行狂犬病毒暴露后预防并在发展中国家得到广泛使用。

4 结语

从血清多克隆抗体到杂交瘤单克隆抗体，从鼠源单克隆抗体到 1984 年的人-鼠嵌合抗体，标志着基因工程抗体诞生，随后新型基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体、多价小分子抗体等。但早期的基因工程抗体均有其各自的缺点，如基因取自杂交瘤细胞，生产抗体的流程复杂，嵌合抗体和人源化抗体不能完全解决 HAMA 反应，难以对抗体进行改造获得高亲和力抗体等。20 世纪 90 年代初，建立了噬菌体抗体库技术，采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于制备稀有抗原的抗体、能获得人源和高亲和力抗体。

如今，获得人源抗体的方法越来越多，如噬菌体展示、核糖体展示、酵母展示或是使用转基因技术产生的具有人免疫球蛋白基因的小鼠均能获得人源抗体。而 PER.C6 等单克隆抗体的高效表达细胞系则为人源单克隆抗体进入临床治疗的大规模生产获得低成本抗体提供了保证。目前已经有几十种人源的单克隆抗体进入临床的治疗试验阶段，这些单克隆抗体针对的抗原包括肿瘤、自身免疫疾病和传染病中的主要抗原，如针对黑色素瘤的 4B5，针对干扰素的 D2E2 和针对乙肝的 Ostovir 等。

随着对狂犬病毒糖蛋白及其单克隆抗体研究的不断深入，如何用单克隆抗体取代现有被动免疫制剂的思路越来越清晰。从最早将针对糖蛋白、核蛋白等不同蛋白的单克隆抗体组成单克隆抗体鸡尾酒，到目前最新的单克隆抗体鸡尾酒CL184 临床实验的成功。随着不断出现更新更好的人源单克隆抗体，单克隆抗体鸡尾酒取代人 RIG（HRIG）和马 RIG（ERIG）进行狂犬病暴露后预防只是时间问题。

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基金项目：国家高技术发展研究计划（863 计划）（2009AA02Z109）

作者单位：100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室

通讯作者：梁米芳，Email：mifangl@vip.sina.com

收稿日期：2010-03-03

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.009