利用噬菌体展示技术研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用——与酵母双杂交方法比较

张佳娣，石屹峰

利用噬菌体展示技术研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用——与酵母双杂交方法比较

张佳娣，石屹峰

近年来基因组测序工作已揭示了数以万计的新基因，但是这些基因序列的价值只有当这些数据被翻译成蛋白质功能的时候才能被了解。而蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能，而且为我们更好地理解生命过程、疾病机制和新药开发等提供了一个很好的基础。当前随着人类基因组和众多生物物种全基因组测序的完成，功能基因组学（functional genomics）成为研究的主流，它是对基因组中包含的全部基因及其所翻译的蛋白质的功能加以解读和描述，尤其是大量未知基因的功能及其对应的蛋白质产物的功能。在研究功能基因组方面已有许多生物化学和生物物理方法，其中噬菌体展示（phage display technology，PDT）和酵母双杂交（yeast two-hybrid system，Y2H）是比较成熟的生物技术。噬菌体展示技术诞生于 1985 年，在抗体库展示方面取得了巨大的成功，也被用于研究蛋白质-蛋白质相互作用和未知基因克隆等多个分子生物学领域[1]。酵母双杂交方法诞生于 1989 年，它被广泛用于研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用，但是噬菌体展示技术在研究蛋白质-蛋白质相互作用方面具有一些独特的优势[2]。本文综述了噬菌体展示技术在克隆功能基因和研究蛋白质-蛋白质相互作用方面的最新进展，同时将噬菌体展示技术与酵母双杂交方法进行了比较。

1 噬菌体展示技术与酵母双杂交方法的比较

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的 DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面[3]。通过体外亲和（绑定）靶分子筛选到的噬菌体克隆经过下一轮扩增而富集。该技术的主要特点是展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因相连接，具有基因型与表现型相一致的特征，因而可以快速准确地对筛选出的结合肽或结合蛋白的基因序列进行分析。由于噬菌体肽库可以在大肠杆菌中进行不断扩增，因此保证了淘选的连续性，为筛选出亲和力和选择性较高的肽或蛋白质提供了极大的可能。

酵母双杂交作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间相互作用的方法是在真核模式生物酵母中进行的，其原理是利用酵母转录因子 GAL4 蛋白结构上组件式的性质，即 GAL4 由两个结构上可以分开、功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有 DNA 结合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的 GAL4 转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）的启动子，使下游基因得到转录。当我们将已知蛋白作为诱饵（Bait），从 cDNA 基因文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白质时，将编码已知蛋白（诱饵蛋白）的基因与BD 基因融合（BD-Bait），编码未知蛋白（捕获物，Prey）的基因与 AD 基因融合（AD-Prey），如果 BD-Bait 和AD-Prey 共表达于宿主细胞中能发生相互作用，会使 AD与 BD 形成一个完整的转录激活因子，并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定，可以很容易地知道待测蛋白 Prey 是否与已知蛋白 Bait 发生了相互作用。如果将 Prey 换成基因文库，即可直接从基因文库中筛选到能与 Bait 相互作用蛋白的 DNA 序列。因此，酵母双杂交技术也成为研究未知基因与已知基因之间功能相关的主要方法[4]。

噬菌体展示技术与酵母双杂交技术应用于功能基因筛选和蛋白质-蛋白质相互作用研究时分别具有各自的特点：①序列多样性：噬菌体展示技术与酵母双杂交技术相比展示的序列多样性更大，噬菌体展示技术能在 109个克隆中筛选出一个，而酵母只能在 106个克隆中筛选出一个，因而筛选功能基因更敏感，在对蛋白质-蛋白质相互作用的作图方面更具有优势[2,5]；②诱饵蛋白（靶分子）：对于整个基因组的大规模蛋白质-蛋白质相互作用的鉴别，酵母双杂交方法比噬菌体展示技术更有效，这是因为酵母双杂交方法直接使用诱饵蛋白的基因而不涉及对它的纯化，因而它的成本会比噬菌体展示技术低一些。由于噬菌体展示技术需要纯化的蛋白质作为靶分子蛋白，因此大规模蛋白质-蛋白质相互作用的鉴别可能会有很高的成本[2,5]；③“假阳性”结果：酵母双杂交方法的一个重要的问题是“假阳性”。所谓“假阳性”，即通过双杂交观察到的蛋白质之间的相互作用在真实情况下不一定发生。由于某些蛋白质本身具有激活转录功能，使 DNA-BD 在无特异激活结构域的情况下可激活转录；另外某些蛋白质表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白质形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果[6]。对于噬菌体展示技术，靶蛋白在包被筛选孔板的过程中可能发生构象松弛，这也会导致捕获多肽或蛋白质的特异性降低；④趋同进化：利用噬菌体展示的随机肽库可以筛选出与靶蛋白相互作用的一些肽段，这些肽段与天然（捕获）蛋白质的相互作用部位很相似，这种现象被称作“趋同进化”[7]。通过检索全部基因组数据库找到共有序列，再通过实验验证其是否是所要选择的相互作用蛋白（配体）[8]。以这种方式噬菌体展示随机肽库获得的信息量较酵母双杂交方法大很多，也可用于对蛋白质-蛋白质相互作用作图；⑤体内与体外筛选“场所”：酵母双杂交方法在真核细胞内进行，有体内翻译后修饰，一定程度上代表细胞内的真实情况，但是对研究大量非核内蛋白质有局限，不适用于膜受体、细胞外分泌蛋白质等。噬菌体展示技术是体外筛选因而更具灵活性，在一些特殊的试验中，比如当靶蛋白（诱饵蛋白）和结合蛋白（捕获蛋白）属于不同物种时，比如对过敏原或者小分子结合蛋白质的克隆，噬菌体展示技术对于结合蛋白的鉴别非常有效[9]；⑥时间和费用：噬菌体展示方法需要 1 ～ 2 周左右筛选数以十亿计的克隆，费用较低；而酵母双杂交需要 1 ～ 4 个月筛选数以百万计的克隆，费用较高。噬菌体展示技术与酵母双杂交方法的比较可见表 1。

2 噬菌体展示系统表达基因组 cDNA

噬菌体展示技术已经成功应用于抗体库（antibody library）技术和随机肽库（random peptide library）技术，然而噬菌体展示 cDNA 基因文库的应用比较少而且是低效的。因为 cDNA 基因文库存在无法预测的阅读框和终止子，很高比例的噬菌体克隆不是完整开放阅读框（open reading frame，ORF）编码的蛋白质，故噬菌体展示技术最初没有像酵母双杂交方法那样应用到功能基因组的研究和阐明蛋白质-蛋白质相互作用。但是通过发展 C-端展示和 ORF cDNA 基因文库等一些策略，可以很好地解决以上的问题。这些改进的噬菌体展示技术继承了其应用于抗体库展示的优点，而且能高效、灵敏和准确地鉴定内源性蛋白质[5]。

丝状噬菌体包括 M13、f1、fd 等[9]，其基因组均为一单链环状 DNA，大小约 6.4 kb，主要展示蛋白融合在衣壳蛋白 pIII 上，尽管这一系统在一些工作中被用于 cDNA 展示，但是它并不是最佳的选择。这是因为从 gIII 基因 5’ 端插入 cDNA 的 3’ 端如果包含终止密码子，将阻止融合gIII 基因的表达。因此，在设计表达系统时应该避免 cDNA融合在 gIII 基因的 5’ 端。设计 Jun 和 Fos 亮氨酸拉链系统（Jun and Fos leucine zippers）就能够避免这一问题：Jun-pIII 蛋白在细胞质中生成，并分泌到大肠杆菌的周质中，与在周质中积累的 Fos 融合蛋白聚合，Fos 在其 C 末端与 cDNA 表达产物融合。位于亮氨酸拉链的 N 和 C 末端半胱氨酸使蛋白质与噬菌体以二硫键共价连接，从而避免了噬菌体内的蛋白质交换。该 pIII 展示系统适合表达分子量在 100 kD 左右的大分子蛋白质[10]。另一种策略是cDNA 首先与一个 β 内酰胺酶基因一起被亚克隆到一个载体上，通过氨苄西林抗性筛选来对 ORF 进行筛选[11]。第二步该 cDNA 被亚克隆到噬菌粒（phagemid）内表达，使噬菌体表面表达富集 ORF 文库，这一过程的效率能达到87%，而无氨苄西林抗性筛选效率只有 6%。之后进行重组剪切掉抗性基因得到噬菌体文库[12]。第三种策略，噬菌粒被剪断 gIII 的辅助噬菌体活化。该方式中，噬菌粒需要提供一个完整 pIII 侵染大肠杆菌。如果噬菌粒中克隆的cDNA 不在阅读框架内，那么这个 pIII 融合子就不会成功表达，直到发生适当的阅读框架移动。另外，pVI 蛋白和pVIII 蛋白展示系统也适用于基因组 cDNA 的展示[13]。

表 1 噬菌体展示与酵母双杂交的比较

展示在 T7 噬菌体表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围广[14-15]。M13 噬菌体是非裂解性噬菌体，它在周质中组装，必须经细胞膜分泌；而 T7 是裂解性噬菌体，在细胞质中完成组装后直接从细胞裂解出来。另外 T7 噬菌体展示系统是通过 C 端融合表达蛋白，插入片段被克隆到 T7 噬菌体载体基因 g10 的 C 端。因而即使插入片段内含有终止密码子，也同样可以被其表达和展示，而这是在 N 端克隆的 M13无法进行的。

λ 噬菌体是最早使用的克隆载体，其两端为不闭合的线形双链 DNA，末端为长 12 个核苷酸的互补单链。噬菌体展示系统是通过将外源序列插入噬菌体头部组装必需的蛋白质 D 的 N 端或 C 端，或主要尾部蛋白质 V 的 C 端，实现外源蛋白质的表面展示。λ 噬菌体也是裂解性噬菌体，它在宿主细胞内完成装配，无需将外源肽或蛋白质分泌到细菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白质（100 kD 以上）及对宿主细胞有毒性的蛋白，适用范围极广，目前已被成功地用于 cDNA 基因文库和基因组文库[16]。该系统同样适用ORF cDNA 基因文库表达策略，在开放阅读框 cDNA 上增加一个含有 13 个氨基酸的生物素标签，这一肽段被引入到D 蛋白的 C 末端用于 λ 噬菌体展示，如果插入的 cDNA是位于 ORF，则生物素标签被正确表达并且被大肠杆菌BirA 酶有效生物素化，然后标记了生物素的 ORF 噬菌体被固定的链霉亲和素所富集。有近 79% 的噬菌体能够展示正确的 ORF cDNA[17]。

3 利用噬菌体展示技术研究蛋白质-蛋白质相互作用

随着噬菌体展示系统的不断改进，它在功能基因组学和蛋白质-蛋白质相互作用的研究中成为方便、灵活和有效的工具，近年来在研究疾病发生和治疗如宿主-病原体、免疫原蛋白包括肿瘤抗原和过敏原、信号转导配体、小分子结合蛋白和酶等方面有广泛应用。

3.1 宿主-病原体相互作用

为了利用噬菌体展示技术来鉴定宿主-病原体的相互作用，Jacobsson 和 Frykberg[18]利用超声波处理金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）染色体，将染色体 DNA 片段亚克隆到噬菌粒载体上。对 IgG 和纤维连接蛋白（fibronectin）进行亲和筛选，能从丝状噬菌体展示 107个克隆库中获得已知序列和新序列。这种方法能够分离与哺乳动物靶蛋白结合的细菌蛋白，并已经应用于从不同物种中筛选 DNA 文库，如 Jonsson 等[19]从螺杆菌中、Jacobsson[20]从链球菌中和 Mullen 等[21]从巴斯德菌中分别筛选出DNA 文库。

3.2 肿瘤抗原

使用分离肿瘤特异性抗原细胞的方法筛选抗原并不非常有效，而使用血清抗原分子筛选方法可以找到结肠癌体液免疫（colorectal cancer，CRC）的肿瘤抗原。Somers 等[22]首先构建与丝状噬菌体外壳蛋白 pVI 融合的 CRC 细胞系HT-2的cDNA 文库，其中 CRC 血清来自经历了自身肿瘤主动特异性免疫（active specific immunization，ASI）的患者。通过该 cDNA 基因文库在 CRC 血清中富集，确定了19 个克隆具有反应性，其中 17 个与肿瘤反应。应用该文库筛选出 13 种抗原可以用作肿瘤疫苗或者作为预后的标记。

3.3 过敏原

通过亲和人血清 IgE 抗体可以筛选噬菌体表达的过敏原 cDNA 基因文库。Crameri 和 Walter[23]利用丝状噬菌体展示约含有 108个克隆烟曲霉（Aspergillus fumigatus）cDNA的表达产物，以过敏反应者血清中的 IgE 抗体作靶分子亲和筛选，经过六轮筛选后，一些不同的 cDNA 表达产物被分离出来，其中一些过敏原能够用于诊断过敏性支气管肺曲霉病（allergic bronchopulmonary aspergillosis），它的症状在医疗上不易诊断。

3.4 信号转导配体

真核细胞信号转导途径涉及一些保守的蛋白质结构域，例如 Src 同源家族 SH2、SH3 和 PH 家族。SH2 结构域能够识别含磷酸化酪氨酸的多肽，而 SH3 结构域结合富含脯氨酸和疏水残基的蛋白质。为了鉴别能够结合 SH2结构域的胞质酪氨酸蛋白磷酸酶（cytoplasmic tyrosine phosphatase）SHP-2，构建了与丝状噬菌体 gIII 基因融合的白细胞 cDNA 基因文库（108个），它包含 200 ～ 500 bp 片段。为了降低非特异性结合蛋白质的比例，Videlock 等[24]首先将（磷酸化之前的）cDNA 克隆与固相的 SH2 共同孵育，而噬菌体展示的 cDNA 表达产物在筛选之前被一个蛋白激酶磷酸化。经过筛选发现 SHP-2 能结合磷酸化的血小板内皮细胞黏附分子 PECAM-1 多肽。

3.5 脑疾病蛋白

β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide）在微摩尔浓度上会引起神经元细胞的凋亡。Nelson 和 Alkon[25]利用丝状噬菌体展示技术检测兔脑中 β-淀粉样蛋白的蛋白质相互作用，以鉴定出 β-淀粉样蛋白的受体作用部位。在 8 个能识别β-淀粉样蛋白的合成肽中，有 3 个是 β-淀粉样蛋白引起神经元细胞产生毒害作用的有效阻断剂。这些多肽能够结合β-淀粉状蛋白的疏水区或蛋白激酶 C 磷酸化位点附近，说明了这些区域可能是 β-淀粉样蛋白起效应的关键区域。这些多肽或通过竞争性抑制 β-淀粉样蛋白与它的效应蛋白结合来防止其毒害效应。

3.6 多酶体系

一些遗传疾病与过氧化物酶（peroxidase）的异常有关，表明过氧化物酶体（peroxisomes）中包含了细胞代谢的重要部分。为了进一步研究未知的过氧化物酶的代谢功能，Fransen 等[26]利用 M13 噬菌体展示鼠肝脏 cDNA 基因文库，从中筛选能结合抗过氧化物酶体抗体的表达产物，得到了 4 个 cDNA 克隆。在这4 个克隆中有 2 个是以前熟知的酶，另外 2 个是新酶，根据这 2 个新酶的 C 末端 3 个氨基酸残基作为过氧化物酶体基质的定位信号，通过免疫荧光观察证明了它们是过氧化物酶体的一部分。目前已经发现50 多种代谢酶存在于哺乳动物的过氧化物酶体中。对于过氧化物酶分子水平上基因的鉴定，使我们更好地了解了由过氧化物酶紊乱而导致的某一类疾病。

3.7 小分子药物结合蛋白

FK506（他克莫司）是一种大环内酯聚酮类免疫抑制剂，通过抑制相关多细胞因子的产生和表达来抑制 T 细胞的活化，主要用于器官和组织移植前后治疗机体的排斥反应。它可与 T 细胞胞质的 FK-506 结合蛋白（FK binding protein）结合形成 FK506/FKBP 复合物从而影响信号转导，产生免疫抑制作用。为了分离能够与免疫抑制剂 FK506 结合蛋白，Sche 等[27-28]将人脑 cDNA 文库中的克隆在 T7 噬菌体上表达，然后与修饰后的 FK506 进行亲和筛选。FK506经生物素化修饰包被于固相进行筛选，McKenzie 等[29]最终筛选出了三种同源性的 FK506 结合蛋白。

4 结语

随着 DNA 测序技术的飞速发展，目前 NCBI 数据库已经包括 5799 种物种的基因组数据，研究的焦点也正在从表达基因组转向功能基因组，或者说从基因组学转向蛋白质组学。假如说蛋白质可调节和控制细胞几乎所有活动和功能，那么找到蛋白质之间的物理联系也就是研究蛋白质和蛋白质的相互作用是揭示基因组功能的主要研究策略。作为研究蛋白质-蛋白质相互作用的重要工具酵母双杂交方法和噬菌体展示技术在生物学研究系统中都有一定的局限性，但是由于它们的局限性不同，在很多情况下，它们可以互为补充[30]。比如对酵母 SH3 的蛋白质相互作用作图时，先用噬菌体展示肽库进行亲和筛选，再从酵母基因组数据库中找到共同序列，最后使用酵母双杂交实验来验证，噬菌体展示和酵母双杂交的结合使“假阳性”结果的比例大大降低[31]。对于非体内分子的识别，例如药物基因组学，噬菌体展示技术更加适用；ORF 噬菌体展示 cDNA 技术的进展也提高了噬菌体展示技术在功能基因组研究的有效性、灵敏性和准确性，目前噬菌体展示技术正步入发展成熟阶段，并显示出非常好的实用性，已逐渐成为疾病诊断和治疗方面研究的重要手段[32-33]。

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基金项目：辽宁省教育厅重点实验室资助项目（2008S015）

作者单位：116034 大连工业大学生物与食品工程学院

通讯作者：石屹峰，Email：shiyf@dlpu.edu.cn

收稿日期：2010-02-03

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.010