腺病毒载体，最有潜力的心血管疾病治疗载体？

郝嘉，游凯，肖颖彬

（第三军医大学 新桥医院全军心血管外科中心，重庆 400037）

对心血管疾病进行基因治疗，需高效的基因转移载体和转移体系将目的基因导入心血管，并安全可靠地表达。腺病毒是目前广泛应用于心血管基因转移的病毒载体，腺病毒不仅可感染增殖的细胞，亦感染非增殖的细胞，因此，腺病毒载体最适合于心血管系统的基因转移，目前它已进入临床III期治疗，它应用于心血管疾病的防治已近于现实［1］。本文综述腺病毒载体的性质、优点及发展历程，在心血管疾病中的具体应用，总结目前应用中的障碍和改进策略。

1 腺病毒的基本结构及感染机理

腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，毒粒直径为60~90 nm，长约36 kb，由20面体的蛋白质外壳和蛋白核酸复合核心组成。它由于存在壳蛋白因而可逃避细胞内溶酶体的消化。基因组有编码区和非编码区两部分。在编码区，根据DNA复制周期的不同分为早期基因区和晚期基因区，前者有E1～E4区，为早期转录元，主要编码病毒的调节蛋白；后者分为L1～L5五个区，为晚期转录元，负责结构蛋白编码。大多数腺病毒载体是用腺病毒2型和腺病毒5型构建而来，有潜在临床应用价值的载体绝大多数来源于腺病毒5型［2］。腺病毒感染的机制是进入细胞后先粘附初级受体，然后与次级受体相互作用而内化。病毒包裹在网格蛋白形成的小囊泡中进入细胞，并被运输到内涵体，通过酸化作用去掉衣壳蛋白，脱壳的病毒颗粒侵入细胞质，再被转运到细胞核进行复制。

2 腺病毒载体的优点

腺病毒作为基因感染的载体虽存在某些不足，如表达时间较短和感染器官的炎症反应等，但腺病毒载体仍是极有潜力的外源基因的运载工具，它的优点主要有［3］：

（1）靶细胞范围广，不仅能感染复制分裂细胞，也能感染非分裂细胞，它可介导体内多种组织的基因转移；

（2）携带的外源DNA片段大（最大可至35 kb）；

（3）感染效率高。腺病毒载体所携带的外源基因在体外对血管内皮细胞和平滑肌细胞的感染效率均达100%，体内感染效率可达15%~80%。每10 mm2血管壁上约可感染5 000~10 000个细胞，约为脂质体和逆转录病毒的100倍；

（4）重组病毒产量滴度高，可达1011～1012 pfu/ml，慢病毒载体无此特点；

（5）人类是腺病毒的自然宿主，腺病毒也可作为活疫苗应用，对接种者无明显的毒副作用。它进入细胞内仅瞬间表达，不整合到宿主细胞基因组，安全性明显高于慢病毒载体。腺病毒载体表达持续时间较短的这种特性在心血管疾病基因治疗中十分有益，比如用它转移血管生成因子足以诱导局部血管再生，也不至于引起血管的过度形成；

（6）腺病毒作为真核系统基因调控模型，其基因组结构和功能已有较广泛深入的研究，且理化性质相对稳定，容易制备，这一点明显优于慢病毒载体；

（7）载体没有包膜，不易被补体灭活，能直接在体内应用，且可由静脉注射、肠道吸收或气管内滴注等多种方式给予。

3 腺病毒载体的发展过程

（1）第一代腺病毒载体为E1或E3基因缺失，缺失区插入外源治疗基因，其优点有：在体外的生产效价很高，易感的宿主细胞范围广，病毒基因组整合于细胞染色体外，可避免插入诱变的可能。但此型载体可引发机体产生强烈的炎症反应或免疫反应，且表达外源基因的时间较短导致应用受限。

（2）为解决第一代病毒载体生产中出现的问题，并提高插入基因的量，同时去除E1区和E4区成为第二代腺病毒载体。宿主的免疫反应性和炎症反应减轻，在载体容量和安全性方面也有较大改进。然而，第二代腺病毒仍不能避免残余病毒基因表达物在体内的免疫反应和细胞毒性，导致基因表达的时间有限。

（3）前两代腺病毒的主要弊病在于载体基本结构中的病毒结构基因，第三代载体把它们全部去除，只保留腺病毒必需的顺式作用元件及基因组两端的末端倒置反向重复DNA序列和包装信号顺序，全长不到1 kb。基因全缺失的腺病毒载体（也称无病毒载体、辅助病毒依赖性腺病毒或裸腺病毒）；大部分腺病毒基因缺失的载体称为微型腺病毒载体。第三代腺病毒载体包括携带目的基因载体部分、辅助病毒（反式提供病毒复制包装等）和感受态细胞株（病毒包装的场所）。常借助填充片段DNA（如λ-噬菌体、酵母、细菌、非人源DNA以及次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列）完成基因组大小的壳体化。第三代腺病毒载体引起的细胞毒性和免疫原性大幅度减弱，在它的载体中引入核基质附着区基因可使外源基因保持长期表达（最长达10个月以上），并可增加稳定性。目前仍在不断改进，如RAPAd2腺病毒系统、Ad35 载体等［4］。

4 腺病毒载体在心血管疾病中的应用研究

（1）腺病毒载体在心肌缺血中的应用研究

在猪心肌缺血模型中，Grines等［5］构建编码成纤维细胞生长因子-4的复制缺陷型人5型腺病毒载体，经冠状动脉内注射后，可显著改善心肌收缩功能和心肌缺血部位局部血流状况，这种作用在2 w时最明显，且可持续12 w，并没有发现明显副作用。在大鼠左冠前降支结扎模型中血管腔内注入鞘氨醇激酶腺病毒载体，可促进新生血管形成和减少心肌纤维化，从而有效地防止缺血再灌注损伤和缺血后心力衰竭［6］。在γ射线心脏照射大鼠模型中，心肌内注射入表达肝细胞生长因子的腺病毒载体，可显著改善心肌血供和心脏功能，这种保护作用在照射180d 后也可观察到［7，8］。Wei L 等通过腺病毒载体过表达无ODD区域的缺氧诱导因子，观察对心脏移植时缺血再灌注损伤的保护作用，发现这种载体是观察移植物功能障碍的有效工具［9］。在导入β肾上腺素的转基因小鼠模型中，经体循环注入编码松弛素的腺病毒载体，可显著改善心肌纤维化，且不影响其它器官正常的胶原水平［10］。在大鼠心肌梗塞模型中利用腺病毒载体导入人基质细胞衍生因子1α，可抑制梗死部位的胶原合成和沉积，显著改善心脏结构和功能［11］。

Yuan B等［12］将18名冠心病分为3个组，每组6名，在接受冠脉搭桥术时心肌内直接注射肝细胞生长因子腺病毒载体，按给予剂量分为3组，分别为5×108（低）、1.5 × 109（中）和 5×109（高），低、中、高 3组分别有3、5、6名的注射部位心肌灌注得以改善，且无明显副作用。另一临床实验是在60例慢性稳定性心绞痛病人中，经冠脉内注入携带成纤维细胞生长因子-4基因的腺病毒载体，治疗后患者症状有所改善。

（2）腺病毒载体在血管再狭窄中的应用研究

在患有冠心病的病人中，代偿性侧支血管并不足以改善组织缺血状况，基因治疗血管再狭窄一直是很诱人的手段［13］。治疗性血管生成则是指引入外源的生血管因子，促进血管的形成，以改善缺血组织的血液供应，治疗性血管生成研究已进入临床前和临床试验阶段。血管再狭窄的基因治疗多依赖于腺病毒介导的局部血管内基因转移系统，相关的研究层出不穷。腺病毒载体转移抗狭窄的基因作为冠状动脉成形术时的辅助措施很合适，因为甚至短暂的血管平滑肌细胞增殖的抑制，就足以限制再狭窄损伤的形成，而减少外源基因可能产生的毒副作用。冠状动脉内注射的腺病毒只有1.3%外漏，且在肝脏、视网膜和骨骼肌未测到病毒DNA，局部未观察到炎症反应、细胞坏死和纤维化。主要的研究结果有：

①气囊损伤颈动脉模型研究

在气囊损伤兔颈动脉模型中，腺病毒介导的生长终止特异性同源盒基因感染颈动脉，可阻止血管平滑肌细胞停止在G0期，减少新内膜增生和血管腔狭窄。携带碱性成纤维细胞生长因子基因的重组腺病毒干预气囊损伤大鼠颈动脉，2 w观察到明显的剂量依赖性内膜和中膜面积比值降低，同时在兔股动脉损伤模型感染该载体，也观察到相似结果。用腺病毒载体将具有免疫调节特性的Fas蛋白配体感染气囊损伤的颈动脉，可抑制血管进一步损害，诱导中膜血管平滑肌细胞凋亡和抑制内膜增生（60%）。用腺病毒载体局部转移iNOS于猪冠状动脉成形术后内膜，亦明显抑制其内膜增生（52%）。

腺病毒介导一氧化氮合酶感染体外培养血管平滑肌细胞，发现一氧化氮表达较对照组高100倍，体内实验应用于损伤大鼠颈动脉，使新内膜形成几乎全部被抑制（>95%），可持续6 w。针对损伤大鼠颈动脉的体内实验中，用腺病毒转移编码G蛋白βγ亚基信号的多肽抑制剂基因（血管平滑肌细胞增殖相关基因），感染该载体后可显著减少血管内膜增生（70%）。用腺病毒载体转移P53基因于大鼠损伤颈动脉，发现新内膜形成显著减少，且呈剂量依赖性。腺病毒介导的GATA-6局部转移至气囊损伤血管壁，使损伤的GATA-6的下调逆转来促进血管平滑肌细胞分化且能抑制大鼠颈动脉内膜的增生。

②颈动脉基础研究

用腺病毒将胸腺嘧啶激酶基因在损伤后立即或1 w内转入大鼠颈动脉、猪髂动脉及粥样硬化性兔髂动脉来抑制血管平滑肌细胞增殖，I/M比值降低，新内膜增生减少40%~60%。过表达谷胱甘肽-S-转移酶的腺病毒载体导入颈动脉中可保护血管壁氧化损伤，并防止兔颈动脉移植桥动脉粥样斑块形成［14］。用腺病毒载体介导的人金属蛋白酶组织抑制剂cDNA感染大鼠血管平滑肌细胞，其基质金属蛋白酶依赖的迁移下降，新内膜面积减少。将携带尿激酶纤溶酶原激动剂的第三代腺病毒载体注射到兔子颈动脉中，发现血管内皮细胞内持续高水平表达该外源基因，宿主的免疫炎症反应较低，治疗基因的表达水平比内源性表达高3倍，提示其可较好地应用于血管疾病的治疗。

③大隐静脉桥和颈动脉桥血管研究

利用腺病毒载体将人基质金属蛋白酶-3基因导入兔颈静脉中，颈动-静脉吻合模型中的静脉管腔直径和血流可明显改善。在相似的动物模型中，采用环氧合酶1或人组织性纤维蛋白溶酶原基因转染静脉桥也取得了很好的疗效。多名学者认为基因治疗在桥血管狭窄防治中仍具有良好的研究意义和应用前景。

（3）腺病毒载体在高血压中的应用研究

Miller等［15］在大鼠卒中易感型自发性高血压动物模型中，颈动脉注入腺病毒介导一氧化氮合酶进行干预，因为这种体循环导入方式缺乏靶向性，并没有达到有效地调节血压升高的效果。作者改用生物特异性抗体结合于腺病毒受体和柯萨奇病毒，可靶向血管紧张素转换酶，大大促进血管中内皮细胞NO合成酶的表达达到调节血压的效果。有学者采用腺病毒载体介导的内皮细胞一氧化氮合酶和Rho蛋白激酶显性负性突变体转入调控血压的关键部位--大鼠孤束核和前腹外側延脑，这种手段可有效地观察一氧化氮和Rho蛋白激酶的生理作用［16］。

（4）腺病毒载体在其它心血管病中的研究

在心脏放射照射模型中，核苷三磷酸焦磷酸酶是调节血管二磷酸腺苷（血小板富集血栓形成的关键因素）代谢的重要因子，采用表达人核苷三磷酸焦磷酸酶同工异构体I和II的腺病毒载体感染平滑肌细胞后，发现同工异构体I可显著地发挥抗血小板聚集的效果，而同工异构体II却无此功效；进一步将表达同工异构体I的腺病毒载体经颈动脉注入，在大鼠照射模型中发现血栓形成和继发的内膜增生均被抑制，说明在损伤血管中局部表达核苷三磷酸焦磷酸酶，可能预防动脉血栓形成和继发的内膜增生［17］。

在主动脉缩窄模型的研究中，Shimano在脂联素基因敲除大鼠主动脉缩窄模型中，给予腺病毒载体介导的血管内皮细胞生长因子，可逆转微血管的形成，并可改善心脏功能［18］。在主动脉束缚的大鼠左室心肌肥大模型中，使用编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16INK4a的腺病毒载体用心导管输入，2 w后可明显抑制心肌肥大，这表明G1细胞周期调节因子可能限制心肌肥大，这可能是心肌肥大的基因治疗方式［19］。

Ivanciu等［20］将腺病毒介导的组织因子途径抑制物2感染大鼠模型，发现新生血管减少，细胞外基质沉积，这说明组织因子途径抑制物是血管异常增生的重要凋节因子，它与心血管疾病、慢性炎症甚至肿瘤、糖尿病密切相关。将辅助病毒依赖型腺病毒载体和第一代φE1载体注射入大鼠心肌内，用ELISA法测定不同时相点GFP的表达，测定细胞因子表达，并观察单核细胞、巨噬细胞和CD4+、CD8+淋巴细胞等炎性细胞浸润情况，发现辅助病毒依赖型腺病毒载体载体优于第一代腺病毒载体，可应用于心血管病基因治疗中［21］。

（5）腺病毒载体感染率和导入方式的研究

针对腺病毒载体感染率和导入方式的研究中主要有五种方式：心肌直接注射（开胸时采用）、冠状动脉（冠脉搭桥术或建立心肌梗塞模型时采用）、颈动脉注射（心导管引导下或体外分离后应用）、体循环静脉注射（门静脉或尾静脉）、后腿肌肉注射。给心肌直接注射腺病毒载体有很高的感染率，腺病毒感染β半乳糖苷基因酶于心肌细胞后发现该基因的表达占心肌细胞的10%~32%，而以前的转基因方法该基因在心脏的表达不足1%。Christopher等直接注射腺病毒载体于大动物模型心肌，2 d后转基因表达达高峰并可持续14 d，表达面积更广；注射后7 d，远处器官的转基因表达仅占心肌的0.1%，且对心脏功能、动物存活无明显影响。但这种方法常需要开胸手术和呼吸机支持。将Ad-VEGF121直接注入猪心肌缺血模型心肌，基因表达是一过性的，且集中在心肌缺血区，局部表达的VEGF比经冠脉给药的浓度大10倍，而且使局部心肌血流改善。

5 腺病毒载体主要的问题和改进方法

腺病毒载体作为基因治疗重要手段，它能够感染终末分化细胞，不整合入宿主，避免了插入突变的可能，也具备感染效率高、体外稳定、易于纯化的优点，但它仍有一些缺陷限制了它的使用。主要为：

（1）安全性问题

在用基因治疗纠正疾病缺陷时，其安全性研究及评价也就成为人类普遍关注且迫切需要解决的问题。通过病毒将外源基因携带入人体，会不会干扰人体正常的基因活动？会不会在人体发挥应有的正常作用？作为载体的病毒会不会重组出新的高传染性疾病（如脑炎）或发生肿瘤？导入或去除遗传成分，是否会危及人类的生存？

（2）免疫反应问题

腺病毒载体可与细胞基因的重组，使腺病毒结构蛋白表达，引起机体免疫反应。天生的和后天形成的针对腺病毒载体的免疫反应仍是这项技术应用的严重障碍，因为免疫反应不仅可使外源基因表达时间缩短，而且可能导致严重的副作用［22］。第三代腺病毒载体也能引起一定程度的免疫反应，但第三代腺病毒载体引起的免疫反应要较第一代腺病毒载体引起的免疫反应弱［23］。产生免疫反应的机制主要和TCD4+、CTLS介导的免疫有关，B淋巴细胞也可能参与。免疫反应早期先有炎症介质（CXC、CC、MCP、IP10等）聚集，然后吸引中性粒细胞、CD11b+细胞参与介导免疫反应。

目前的主要对策为：①小剂量免疫抑制剂（环磷酰胺、FK506）、CTLA4Ig、抗CD40抗体等都能延长基因表达的时间；②诱导免疫耐受：在新生小鼠的胸腺内注射腺病毒或腺病毒蛋白质外壳或受腺病毒感染的肝细胞，使T细胞对其不能发生免疫应答。③对腺病毒载体进行修饰、改进以消除或减少免疫反应；④采用芯片技术、转基因细胞株或基因敲除鼠和新一代的腺病毒载体，以期深入探讨细胞内的免疫防御机制［24］。

（3）感染效率问题

目前仍在不断探索进一步提高腺病毒载体感染效率的方法。Sharif F等［25］比较腺病毒和腺病毒相关两种载体在心血管疾病中作用的异同时，在颈动脉腔内注射入载体，发现腺病毒载体全部在内皮细胞中表达，而腺病毒相关载体主要在平滑肌细胞中表达，说明它们适用于不同的心血管疾病基因治疗中。目前对腺病毒载体衣壳蛋白质的遗传修饰是提高其对宿主细胞感染效率的主要途径［26］。有学者对人巨细胞病毒启动子/增强子进行改良，大大增强了腺病毒载体在平滑肌细胞中的基因转移效果［27］。整合素α3β1在成熟心肌细胞中表达下调，导致细胞内吞腺病毒的能力下降，这可能是腺病毒载体针对这类成熟细胞感染率低下的关键原因［28］。

（4）基因转导的靶向性和给药途径

准确地将腺病毒载体导向靶部位，提高局部治疗因子浓度，延长局部滞留时间，减少进入全身循环的量，给药方式的选择也是很重要的。患者对血管内注射的重组腺病毒载体具有良好的接受能力，但在7.5×1013个粒子时可出现心功能受抑情况。为了解腺病毒载体对心脏的具体作用，研究者将不同剂量的载体经体循环血管腔内注射后，并监测心电图，发现载体与特定细胞如枯否氏细胞的网状内皮系统相互作用，从而影响心电信号传导［29］。

尽管给药方式多样，但临床治疗中最大的障碍是细胞毒性和腺病毒扣押在非靶向组织，参与的因素和机制仍不明了。静脉注射的病毒颗粒绝大多数扣押在肝脏并继发炎性反应。凝血因子IX和C4补体复合物结合蛋白可结合于腺病毒纤维顶端球域，提供病毒被内吞的桥梁。一种名为Ad5mut的新颖载体，它含有突变纤维顶端球域，在体内实验中表现出肝细胞感染率和肝毒性下降，这可能成为体循环应用腺病毒载体的新颖手段［30］。

（5）大规模生产和纯化问题

目前为尽量减少辅助基因组自身的包装效率、分离第三代腺病毒与辅助病毒，优化方法主要有Cre-loxP重组系统、FLP-frt重组系统、φC31-attB/attP重组系统、容量限制型蛋白IX-缺失辅助细胞、非腺病毒载体作辅助病毒、Av1S4BflxFE3辅助病毒。这些方法可有效减少辅助病毒的重排，从而增加第三代病毒载体的产量。

6 展望

心血管疾病是影响人类生命健康的头号疾病，腺病毒载体以其独特的优越性而在心血管疾病的基因治疗中被广泛应用，新的载体系统不断完善和发展，相关基因试验报道和治疗研究层出不穷，目前已进入三期临床实验。针对恶性神经胶质瘤的腺病毒载体定位码基因注射剂（Cerepro）已在法国批准并上市，展现了腺病毒载体的极大应用前景。但它从实验研究走向成熟稳定的临床应用，还需要在腺病毒的分子生物学、载体优化设计、安全性评估等方面展开深入的广泛的研究，从而真正发挥其在基因转导和基因治疗上的优势和潜力，最终为心血管疾病的基因治疗服务。

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