基因转染的纳米技术

田 刚,李 华

(兰州军区乌鲁木齐总医院神经外科,新疆乌鲁木齐830000)

基因疗法通常是治本而非治标的方法,其选择常遵循“优后原则”。因此,为了治疗目的要将基因物质输送入细胞内。最近由于对基因在疾病中的重要性的了解和基因组学范围内的许多突破,使生物技术有了很快的发展,因此对治疗遗传性和获得性疾病都提供了极大的希望。特别是某些人工合成的“非病毒性物质”作为基因载体很管用。此外,纳米颗粒不但可以作为有效的基因载体,而且能同时携带诊断性探针直接“实时”观察到基因转移及其下游过程。最近对纳米技术的研究引起了对药物或基因输送技术的研究和对近代DNA疗法的进一步了解。

1 几种常用的基因载体

1.1 肽类有可能作为对生物医学应用的不同需要而引入有生物学活性的功能性生物物质。Lo等报道[1],Tat是一种可透入细胞的阳离子肽,能够增强细胞摄入更多的许多种类的分子,包括药物和蛋白质。Lo等发现用与10个组氨酸残基共价结合的Tat肽(Tat-10H)要比原来的Tat肽的基因转染活性高7 000倍之多。如果再将两个半胱氨酸残基引入Tat-10H中,则生成的双半胱氨酰组氨酸肽要比Tat-10H肽的效率更高。这证明应用多功能性肽可以有效提高Tat载体的基因运送效率。

1.2 脂质体是通用的亲水和亲脂药物运送载体。脂质体是纳米范围的双层磷脂小泡,它实际上不会引起毒性或抗原性反应。现在用脂质体运送药物已在临床用于治疗癌症和真菌性疾病。脂质体去除巨噬细胞是目前治疗实体瘤的一个新方法。脂质体,特别是脂类-蛋白质复合物(称为lipoplexes)能够竞争,且超过病毒基因的转染系统。Schwendener预测[2],将来的药物运送系统主要基于蛋白质、肽类、和DNA疗法。由于脂质体的多样性,它将在药物运送系统中占据主要地位。

1.3 polyplex微团 基因疗法要求无毒性和高效的DNA和RNA运送系统。多聚阳离子与DNA的复合物称为polyplex,近来已经被认为是运送基因的良好载体。Han等报道[3],在侧链中具有不同多胺结构的多聚阳离子是从核内体中逸出所必要的,而聚乙二醇化是为了保持其稳定性和生物相容性。应用这样一个在其侧链上有N-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基的polyplex微团的聚(乙二氨)-b-聚(N-取代的天门冬酰胺)共聚物形成的polyplex微团系统,可以得到转染效率很高、细胞毒性很低的运送系统,而这后两种性质正是活体内基因成功运送所必需的。

在骨再生医学中基因疗法是一个很有前途的治疗法。但需要有安全和高效的非病毒基因运送系统。Itaka等报道[4]了应用生物相容性polyplex纳米微团进行活体内基因转移以调节骨的再生。

1.4 lipoplex Mozafari等报道[5],单独应用无机纳米粒子,或与胶体颗粒系统(例如纳米脂质体)联合应用,证明是运送基因的一种先进方法,对基因转移有阳性效果。在运送核酸中,两价阳离子的应用,特别是应用阳离子脂质体-DNA复合物(lipoplex)有可能改进转染的效率。Tresset等报道[6],可用一层脂类包裹一个杆状的DNA,脂类是作为分子胶。应用Ca2+和La3+的转染实验证明效果很好。用四价的精胺聚合成的复合物对磷脂的转染效率很高。这些复合物对将来发展更安全的基因运送方法必将有所启发。

1.5 电穿孔法是将外来的不透性分子,例如药物和基因,植入细胞中的有效方法。传统的电穿孔法是应用短促的电脉冲。Wang等[7]应用一种微流体性电穿孔法(microfluidic electroporation technique),不用脉冲电流,而用恒压直流电流(DC),这种方法在筛选药物和基因时可获得较高的单位时间完成量。

自体移植术(取自病人用于病人)中取自骨髓的间质干细胞(MSC)可用于病人的自体移植。但是对干细胞的遗传修饰的大部分方法,如电穿孔法,其DNA转染的效率仅为约10%。Valero等报道一个＞75%的高效方法[8]:在微液态装置(microfluidic device)中用单个细胞电穿孔法,可高效地用于小范围内对细胞的遗传修饰,这可用于在单个细胞水平上研究细胞的过程。将来还有可能应用于治疗。

1.6 磁转染法 Bhattarai等[9]用己酰氯修饰的、壳聚糖稳定的氧化铁纳米颗粒(Nac-6-IOPs)进行病毒基因(Ad/LacZ)的运送。这个载体在外界磁场的影响下能和K562细胞结合,并在这些细胞中强力表达转基因。在活体内,磁转染法证明,Nac-6-IOPs可以应用在其它细胞系中,作为载体,有很高的转导效率。

我国同济医学院的Wei等报道[10],可应用聚乙烯亚胺包裹的磁性氧化铁纳米颗粒(称为polyMAG-1000)作为基因载体。这类纳米颗粒能结合和保护DNA。当纳米粒子和DNA的比率为1∶1(v:w)、且磁场存在时,其转染效率最高(51%)。

2 纳米技术

纳米颗粒和细菌均可用来将基因和蛋白质导入哺乳动物细胞中,用以调节或改变基因表达和产生蛋白质。我国学者北京协和医科大学的 Li等指出[11],纳米颗粒可以作为载体,在体外和体内转染特异的基因进入细胞中。Akin等[12]同时应用纳米颗粒和细菌在活体内和体外导入基于DNA的药物分子。在实验中可用荧光或生物发光基因作为货物(cargo)置于纳米颗粒上,再将之放在细菌的表面。当和细胞一同培养时,这个“微生虫(microbot)”即被细胞所内吞,从纳米颗粒上释放出来的基因即会从此细胞中表达。用此“微生虫”注射小鼠可见在各个器官中有发光,表示基因已表达。这种新方法可用来将不同的货物送入活的动物和各种培养的细胞内,方法比较简便。Han等指出[13],多功能性的金纳米颗粒可为药物运送构成高度稳定的和多样性的支架。颗粒的表面可进行调谐以适应其特异的目标细胞和控制药物的释出。应用纳米材料作为载体,运送治疗性物质到靶组织中已成为目前的普遍手段,并有很大可能用以治疗很多疾病。Cai等[14]运用纳米技术运送一般的基因,特别是治疗眼疾。他们用紧密结合CK30-PEG的DNA(CK30-PEG为其N端有一个半胱氨酸残基和30个赖氨酸残基的聚乙二醇)纳米颗粒,成功地应用于眼、肺、和脑。发现这些颗粒较其他非病毒载体有较高的转染效率和更长的表达时间,而且没有任何毒性或其他副作用。这些颗粒已被安全地应用于临床,且在基因治疗的应用上有大范围的有效性。

2.1 多功能外壳型纳米装置(MEND)为了使基因能有效地运送至目的细胞的核内,非病毒载体必须要克服某些屏障,例如细胞的质膜、核内体膜、和核膜。为了克服这些障碍,运送系统必须具有各种功能性装置。困难之点在于如何把这些装置放在一个单一系统中,而且使它们每个都在恰当的时候和恰当的地方起作用。Kogure等提出了一个新的包装概念[15]:将有各种多功能外壳型纳米装置(MEND)用作为运送质粒DNA(pDNA)、寡聚脱氧核苷酸、和siRNA的非病毒运送系统。现在已有了各种型的MEND。例如,用八聚精氨酸修饰的MEND(R8-MEND)所包裹的pDNA就有显著的、可与腺病毒相比拟的转染活性,而且R8-MEND的摄入途径是一种巨型胞饮作用,因此可避免溶酶体的降解作用。通过活体局部应用R8-MEND能将一个基因运送到小鼠皮肤的毛囊中。所以Kogure等认为,基于MEND的方法是一个很有希望的运送pDNA和功能性核酸的新的运送系统。

2.2 Kumar等报道[16],聚乳酸/聚甘醇酸共聚物Poly(lactide-co-glycolide).(PLGA)是一种生物相容性的和可被生物降解的聚乳酸和聚甘醇酸的共聚物,能够运送基因。然而用PLGA纳米颗粒运送基因的缺点是此颗粒带有负电荷,难以通过粘膜屏障。Kumar等将PLGA纳米颗粒的表面用阳离子壳聚糖修饰以增强其运送基因的能力,造成流体动力学直径＜200 nm的纳米颗粒。应用带有编码绿色荧光蛋白的质粒的PLGA颗粒能在体外转染上皮细胞,但其运送基因的效率似尚不如脂质转染胺试剂(lipo-fectamine)的高。PLGA还能运送基因通过活体小鼠的鼻粘膜,并在体内表达,且不引起炎症。作者认为,壳聚糖修饰的PLGA纳米颗粒作为基因载体很有前途。

2.3 You等[17]装配了用编码增强绿色荧光蛋白质(EGFP)质粒所囊包的壳聚糖海藻酸钠(chitosan-alginate)核壳纳米颗粒作为样板,制作了DNA包裹的平均大小为64 nm(N/P比率为5至20)的纳米颗粒。You等发现,这种纳米颗粒所达到的基因表达水平几与用聚乙烯亚胺-DNA复合物的水平相符。

2.4 因为具有独特的结构,纳米分子聚酰胺树形分子高聚合物poly(amidoamine)(PAMAM)dendrimers在医学领域广泛应用,目前该系列中高代数级的已有分子量为600 kDa左右的G8代[18],常用策略是树形分子与质粒基因结合后再用来转染。它最初是由美国密西根分子研究所Donald.A,Tomalia等人于1985年合成的一类阳离子多聚物。具有呈辐射状对称的高度分枝结构,该类分子最外层亚单位相连的是-NH2端基。在生理条件下,其NH2基团完全质子化成为带正电荷的—NH3+,与核酸分子主链上带负电荷的磷酸基团形成稳定性高的复合物。用PAMAM dendrimers分子运载核酸物质体外可普遍高效地转染大量不同类型的真核细胞,DNA与PAMAM dendrimers分子复合的过程可使DNA发生结构上的压缩,易于运输及穿透细胞膜。PAMAM dendrimers分子能在空间上阻止核酸酶对复合物中DNA分子的接近,保护DNA不被宿主细胞核酸酶的分解,没有或仅有较低的免疫原性。G5/6代树形分子显示了高效的体外基因传递能力,Qi等[19]将G5/6代树形分子与聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)共轭相连,减少了树形分子的细胞毒性并提高基因递送效能。

3 将基因导入各种不同靶细胞、组织和器官的方法

近年来对将基因导入各种不同靶细胞、组织和器官的研究很多。

3.1 肝细胞 Pathak A等认为[20],肝脏不但有许多重要的功能,而且是肿瘤转移的主要场所。近几年来发现了许多能通过受体介导的细胞内吞作用的针对肝细胞的纳米载体。这对消灭影响肝脏的遗传性和获得性疾病提供了希望。可以应用各种可能的输送系统,如脂质体、lipoplexes、polyplexes、纳米颗粒等等通过受体介导的细胞内吞作用将外来的治疗性DNA选择性地置入肝脏的特定细胞中。已知存在着各种受体(例如无唾液酸糖蛋白受体)能针对肝脏的实质细胞,所以有可能得到治疗肝脏疾病的、基于DNA的药物。在核酸疗法中,将寡核苷酸送入特定的细胞中并保持其生物学功能是很重要的。Gao等报道[21],半乳糖基化的低分子量壳聚糖(gal-LMWC)是一个将反义寡核苷酸和质粒DNA运送入肝细胞的有效和安全的载体,且有较低的细胞毒性。gal-LMWC和反义寡核苷酸或质粒DNA的复合物的转染效率取决于带阳电荷的壳聚糖氨基和带阴电荷的DNA磷酸基的克分子比率(N/P比)。所以 gal-LMWC可应用于肝脏的基因治疗以增进转染效率。

3.2 神经组织

Roy等报道[22],以中枢神经系统为目标的非病毒基因转移法,特别着重用有机修饰的二氧化硅纳米颗粒作为载体。这种纳米颗粒证明在活体内将基因送入脑细胞中效率很高,并且还有可能观察到控制神经发生和神经退行性疾病的机制。在亨廷顿病和其它聚谷氨酰胺疾病中,脑细胞内出现含有大量聚谷氨酰胺(polyQ)的蛋白质。Klejbor等[23]应用有机修饰的二氧化硅(ORMOSIL)纳米颗粒作为有效的非病毒基因载体,用以模仿大量聚谷氨酰胺肽所引起的脑部病理。例如,用有20个或127个谷氨酰胺重复体(Q20或Q127)与ORMOSIL的复合物注射入大鼠的侧脑室中,可以引起与亨廷顿病和其它聚谷氨酰胺疾病有关的神经病理现象。可见纳米技术能应用于模拟遗传性脑部疾病的病理,可以作为在活体内试验单或多基因疗法的一个新的研究工具。

Wang等指出[24],polyphosphoramidates是一种聚磷酰胺基因传递载体,是良好的鞘内基因载体,其侧链上有伯氨基的要比有仲、叔、季氨基的更为有效。

新加坡的Li等指出[25],聚氨基乙基丙烯磷酸酯(polyaminoethyl propylene phosphate)是一种新的生物相容性聚合物,可作为基因的载体,实现在中枢神经系统中目的基因的持续表达。

新加坡Wang等报道[26],用于神经性疾病的基因治疗的最有希望的基因载体是用腺病毒相关病毒2型(AAV-2)作为载体。在加入一个细胞启动子后,AAV-2载体能引起转基因在脑中持久表达。他们将人巨细胞病毒的立早启动子的增强子与血小板衍生生长因子(PDGF)β链的启动子(是一个神经元特异性启动子)相融合,造成一个杂种启动子。放入AAV-2载体后,将之注射入大鼠的纹状体中,即可出现神经元特异性转基因的表达。注射入纹状体后,可能是由于AAV-2载体的逆向运输,在黑质中亦有基因的表达,但不明显。如果直接注射入黑质中,则在多巴胺能神经元中有转基因的特异性表达。

Tang等报道[27],制成了一种新的非病毒基因载体:聚(乙烯亚胺)-接枝-聚[(天门冬氨酸)-共聚-赖氨酸](简称PSL),这是将天门冬氨酸和赖氨酸在低压下热处理共聚合,再将低分子量分枝聚(乙烯亚胺)(PEI600)结合在其主链上而形成的。此载体的毒性很低,且在浓度为4 000 nmol/l时,细胞的存活率仍超过80%。此载体与DNA的复合物的大小约为150-170 nm,且在其表面上有强阳电荷(超过30 mV)。所以PEI600-PSL共聚物是良好的基因运载工具。高分子量的聚乙烯亚胺(PEI)也是有效的非病毒基因载体,可是在活体内这些PEI可能有较高的细胞毒性。Tang等[27]用无毒性的低分子量PEI与β环右旋糖苷(一种常用的生物相容性药物载体)相连接,制成了一种新的PEI聚合物。这种新的PEI聚合物可作为神经系统疾病的基因疗法时运送治疗性基因物质的运输系统。

Wang CY和Wang S报道[28],带有星状细胞特异性启动子的杆状病毒载体能介导转基因在大鼠脑的星状细胞中表达。他们指出,治疗性基因在神经胶质细胞中的表达有希望用来治疗神经系统的疾病,而杆状病毒载体有希望成为星状细胞特异性基因在脑中表达的有用工具。

3.3 胃肠道组织 在胃肠道的特定部位进行基因运送和转染可用口服微球体系统的纳米颗粒(nanoparticles-in-microsphere oralsystem,NiMOS)。Bhavsar等报道[29],将带有B型明胶纳米颗粒包裹的编码绿色荧光蛋白的质粒DNA(EGFP-N1)的Ni-MOS再用聚ε己基内酯(ε-caprolactone,PCL)作为村质来保护载有DNA的纳米颗粒,形成直径小于5.0微米的微球。为了评价口服后在体内的分布,用放射标记的(111铟)明胶纳米颗粒和NiMOS给空腹Balb/C小鼠口服,可见明胶纳米颗粒可相当快地通过胃肠道,在2小时末已有大于54%的所服剂量到达大肠中,而NiMOS可在胃和小肠中存留较长时间。在口服100微克的EGFP-N1质粒DNA后,在质和量两方面均证明口服NiMOS有转染的能力。服用5天后,在小鼠的小肠和大肠中均可见到转基因的表达。由此可见,NiMOS可以作为用于治疗和疫苗接种的新的运送基因的载体。

3.4 血管内皮细胞 Lu等报道[30],为了测试血管生成抑制因子arresten对肿瘤生长的抑制作用,他们应用分子克隆技术合成含有arresten cDNA的真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)-ss-arresten,再用脂质体将此载体转染入人胃癌细胞SGC-7901中。用Western印迹法可证明此SGC-7901细胞克隆将这种蛋白质分泌入其培养液中。再将表达 arresten的SGC-7901细胞种植在无胸腺小鼠的皮下,可见用此用arresten cDNA进行基因修饰的SGC-7901肿瘤异种移植物的生长被遏制。这是由于在SGC-7901异种移植物中的血管内皮细胞的增殖被arresten所抑制所致。

Akagi等[31]制作了一个新的嵌段共聚物:在其侧链中带有多个乙二胺的单位的聚(乙二醇)-镶嵌-多聚阳离子。这个共聚物可与质粒DNA通过多价离子复合物形成polyplex微团。这个微团能有效地表达基因、对血管平滑肌细胞的毒性很低。血管内注射亦不发生栓塞。所以这种polyplex微团极有希望在治疗血管性疾病时作为非病毒性载体。

3.5 胚胎干细胞 Green等报道[32],生物可降解性聚纳米颗粒可用来帮助非病毒基因进入人胚胎干细胞(hESCs)中。用可水解的阳离子型聚(β-氨基酯)和质粒DNA自身聚合成为带阳电荷的(约10 mV)的小粒子(直径约200 nm)。改变这种聚合物的末端基团,就可以调谐这种纳米粒子的生物物理性质和他们运送基因的效率。一般说来,这些产品的毒性极低,且不会对hESCs群落的形态产生不良影响,也不会引起非特异性分化作用。

人胚胎干细胞是可以更新的细胞来源,对发育生物学和再生医学有很大的应用可能性。Zeng等报道[33],杆状病毒能有效转导人胚胎干细胞。用已引入一个目的基因的杂种杆状病毒载体能在干细胞中产生持久的转基因表达,并且不影响干细胞的正常生长、表型、和多潜能性。所以杆状病毒载体适合应用于对人胚胎干细胞的遗传学处理。

3.6 癌细胞 癌症的基因治疗是新世纪以来现代医学发展前沿对人类最终能攻克这一顽疾的寄希望所在。设若能获得安全而有效的递送系统、RNA干扰技术有望治疗遗传性和获得性疾患,Liu等[34]用纳米分子PAMAM dendrimers来递送针对热休克蛋白27(Hsp27)的siRNA,证实对前列腺癌细胞产生了强大的抗增殖效应。这种载体系统是用柔软可变形的三乙醇胺(triethanolamine,TEA)共轭PAMAM dendrimer为核心,体外实现Hsp27 siRNA成功导入前列腺癌细胞系(PC-3),导致治疗性基因沉默,且siRNA-dendrimer复合物无细胞毒性。

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