沙眼的实验室检查方法进展

刘苹苹,杨颖秋,李 勤

(中山大学附属第五医院,广东珠海519000)

沙眼(trachoma)是由沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)引起的一种慢性传染性结膜角膜炎。因其在睑结膜面表现形成粗糙不平的外观,形似沙粒,故名沙眼。本病早期结膜有乳头增生,滤泡形成,角膜血管翳,晚期眼睑结膜发生瘢痕,致使眼睑内翻畸形,加重角膜损伤,严重影响视力,是导致可预防性失明的主要原因。

1 病原体及发病机制

1.1 病原体

沙眼是由沙眼衣原体所引起的特异性感染。沙眼衣原体属于衣原体的一种。衣原体是一种严格寄生在细胞内,有独特的发育周期,能通过细菌滤器的原核细胞微生物。根据其所致疾病和某些生物学性状不同可分为沙眼生物亚种(Biovar trachoma),性病淋巴肉芽肿亚种(Biovar lymphogranuloma venereum,LGV)和鼠亚种(Biovar mouse)。沙眼生物亚种眼型有A、B 、Ba、C 血清型 ,眼生殖泌尿型有 D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K10 个血清型 。淋巴肉芽肿亚种有L1、L2、L2a、L3 4个血清型 。沙眼衣原体A 、B、Ba、C 血清型主要致沙眼,也可导致泌尿生殖道感染。D-K血清型主要引起泌尿生殖道感染及多种并发症,如尿道炎、前列腺炎、膀胱炎、睾丸炎、附睾炎、宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎、输卵管炎、输卵管闭锁、异位妊娠及肝周炎等,并成为男、女性不孕症的重要病因,此外也可导致沙眼、游泳池结膜炎、新生儿围产期感染(如包涵体结膜炎、肺炎、中耳炎等)。

沙眼衣原体呈球形或椭圆形,直径为0.2-0.4 μ m。Giemsa染色呈紫红色;Macchiavello染色呈红色,在光学显微镜下可以看见。衣原体对热抵抗力较弱,在60℃仅能存活5-10 min;对低温抵抗力强,在-70℃可存活数年,冻干可保存30年以上。70%乙醇0.5 min或2%的来苏5 min均可杀死衣原体。衣原体对大环内酯类和四环素类抗生素敏感。

1.2 发病机制

沙眼衣原体感染宿主后,通过其表面结构吸附至敏感的结膜、角膜上皮细胞上,肝硫素在此起着“桥梁”作用,但细胞表面受体和沙眼衣原体的具体作用尚不完全了解。沙眼衣原体在宿主细胞内生长、增殖时,具有一种特殊的两相生活周期。即具有感染性、发育成熟的原体期和无感染性、发育幼稚的始体或网状体期[1]。沙眼衣原体被膜脂多糖和外膜蛋白为衣原体型特异抗原。沙眼衣原体能产生毒素,毒素与衣原体颗粒结合在一起而不被分泌到体外。沙眼衣原体毒素有抗原性,可被免疫血清中和。机体感染沙眼衣原体后,首先反应为巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞等的浸润,随后发生中性粒细胞反应。树突状细胞表达多种细胞因子和化学趋化因子,如CCR-7,IL-12及干扰素诱导蛋白10,这些因子引导树突状细胞向感染部位游走,并诱导局部保护性的CD4+Th1细胞免疫反应[2]。原发感染多仅引起轻微的组织损伤,再次感染则会迅速引发严重的炎症反应,加重原有的沙眼血管翳及瘢痕形成,甚至睑板肥厚变形,引起睑内翻倒睫,加重角膜混浊,损害视力。合并其他细菌性感染,也使病情加重。关于沙眼衣原体感染发病机制的较普遍观点为:沙眼衣原体热休克蛋白(c-hsp60)作为致敏原引起了宿主的自身免疫应答。在持续性感染中,细胞因子、沙眼衣原体增殖、抗体产生及变态反应的周期性变化造成了慢性炎症和瘢痕形成。

2 临床表现

有接触史:包括家族患沙眼史、集体生活史、共同生活史。患者的工作、工作性质和工作环境。经常从事野外工作、洗手洗脸不便或者农村作业者沙眼发病率高。水源:询问患者使用自来水还是井水。有学者认为,水源传染是沙眼流行的重要因素。个人卫生习惯:是否与他人公用一盆,一条毛巾及一盆洗脸水的习惯。

急性期主要表现为畏光、流泪、异物感,较多黏液或黏液脓性分泌物。可出现眼睑红肿,结膜明显充血,乳头增生,上下穹隆部结膜满布滤泡,可合并弥漫性角膜上皮炎及耳前淋巴结肿大。

慢性期无明显不适,仅眼痒、异物感、干燥和烧灼感。结膜充血减轻,结膜污秽肥厚,同时有乳头及滤泡增生,病变以上穹隆及睑板上缘结膜显著,并可出现垂帘状的角膜血管翳。病变过程中,结膜的病变逐渐为结缔组织所取代,形成瘢痕。最早在上睑结膜的睑板下沟处,称之为Arlt线,渐成网状,以后全部变成白色平滑的瘢痕。角膜缘滤泡发生瘢痕化改变临床上称为Herbet's小凹。沙眼性角膜血管翳及睑结膜瘢痕为沙眼的特有体征。

重复感染时,并发细菌感染时,刺激症状可更重,并且可出现视力减退。晚期发生睑内翻与倒睫、上睑下垂、睑球粘连、角膜混浊、实质性结膜干燥症、慢性泪囊炎等并发症。导致症状更明显,可严重影响视力,甚至失明。

3 诊断

多数沙眼根据乳头、滤泡、上皮、上皮下角膜炎,血管翳(起自角膜缘的纤维血管膜进入透明角膜形成)、角膜缘滤泡、Herbert小凹等特异性体征,可以作出诊断[3]。由于睑结膜的乳头增生和滤泡形成并非为沙眼所特有,因此早期沙眼的诊断在临床病变尚不完全具备时较困难,有时只能诊断“疑似沙眼”,要确诊须辅以实验室检查。

世界卫生组织(WHO)要求诊断沙眼时应至少符合下述标准中的二条:(1)上睑结膜5个以上滤泡;(2)典型的睑结膜瘢痕;(3)角膜缘滤泡或Herbert小凹;(4)广泛的角膜血管翳。

1987年世界卫生组织(WHO)介绍了一种新的简单分期法来评价沙眼严重程度[4]。(1)TF:上睑结膜5个以上滤泡;(2)TI:弥漫性浸润、乳头增生、血管模糊区＞50%;(3)TS:典型的睑结膜瘢痕;(4)TT:倒睫或睑内翻;(5)CO:角膜混浊。其中TF、TI是活动期沙眼,要给予治疗,TS是患过沙眼的依据,TT有潜在致盲危险需行眼睑矫正手术。CO是终末期沙眼。

4 实验室检查

沙眼衣原体(Ct)的实验室检测方法主要有三大类:(1)细胞生物学方法:①涂片镜检;②细胞分离培养。(2)免疫学方法:①直接免疫荧光抗体测定(DFA);②酶免疫测定(ELA);③金标法测定(DIGFA)。(3)分子生物学检测方法:①直接检测核酸技术(基因探针技术);②核酸扩增技术:A.靶DNA扩增;B.探针扩增;C.杂交后信号扩增。

4.1 细胞生物学方法

4.1.1 涂片镜检 取标本后,用碘或Giemsa染色可见寄生于柱状上皮细胞内的包涵体。但因细胞内的包涵体脆性较大,敏感性过低,一般仅限于Ct鉴定而不用于临床。

4.1.2 细胞分离培养[5]Ct专性细胞寄生,普通培养法不生长,只在活细胞内增殖复制。一般用Mc-Coy细胞或Hela-229细胞(或Hep-2细胞)培养,染色后显微镜下观察细胞内包涵体。特异性100%,敏感性低于100%,此法是诊断Ct感染的“金标准”,但操作复杂,技术及设备要求高,所需时间长,敏感性受标本采集、运送、保存等影响较大,且各实验室操作步骤可不同,无标准化[6]。因而不适于临床,多用于科研和疑难病例的终鉴定。

4.2 免疫学方法

4.2.1 直接免疫荧光抗体测定(DFA)[7]荧光标记Ct单抗与Ct结合后,原体(Ebs)在荧光显微镜下发荧光。针对脂多糖(LPS)的抗体荧光弱且染色不匀;针对主要外膜蛋白(MOMP)的抗体荧光亮且非特异染色少。特异性可达100%,科研中常被用作确证实验。敏感性易受感染率的影响,荧光易淬灭,判断结果易带主观性,需优质显微镜及经验丰富者操作。不适于检测大量标本。但操作简便、费用低。

4.2.2 酶免疫测定(EIA)用酶标记的单抗或多抗检测Ct的LPS或MOMP,酶反应生成有色产物,用酶标仪测定。敏感性64%-98%,特异性93%-98%。在高危人群中敏感性较高,新近感染及治疗监测中敏感性明显下降。此法简便、操作自动化,始于短时间内大批量标本检测。但与其它常见微生物可产生交叉反应,如金葡菌、A群及B群链球菌、淋病奈瑟菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯菌及其他革兰氏阴性细菌,使特异性受影响。新一代酶免疫法(ID EIA PCE Chlamydia)采用多聚酶双重反应放大技术,敏感性高于传统酶免疫法2-5倍,为91.8%,特异性为99.8%[8]。

4.2.3 斑点免疫金渗滤试验测定(DIGFA)利用胶体金标记及膜渗滤技术,以Ct单抗作为包被抗体,快速检测Ct。金标法虽然快捷简便,但敏感性太低,漏检率高,从方法学上金标试剂不存在放大效应,有多少抗原显多少色,当抗原量低于一定水平时,就无法显示出人肉眼可见的颜色[9]。目前临床应用并不令人满意,有待进一步完善。

4.3 分子生物学检测方法

4.3.1 直接检测核酸的技术(基因探针技术)利用核酸分子的复性原理,用特定标记探针检测标本中的靶核酸。由最初的放射性标记逐渐发展为酶或化学发光试剂标记。其敏感性和特异性分别为73%-96%和98%-99%,无培养法敏感和特异,成本高,步骤繁琐,已逐渐失去应用价值。

4.3.2 核酸扩增技术 核酸扩增技术主要有[10]:聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),连接酶反应(ligase chain reaction,LCR),Qbeta复制酶试验(Qβreplicase test),自动维持序列复制技术(self-sustained sequence replication,3SR),链置换扩增反应(strand displacement amplification,SDA),Ct基因探针转录介导扩增试验(gen-probe CT transcription-mediated amplification test,TMA)等。其中PCR技术被认为将对Ct感染诊断引起革命性变化[11]。

PCR属于一种核酸体外扩增技术,用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核苷酸序列的扩增。每个循环含变性、退火、延伸3个步骤,2 h内经30个循环可将靶DNA扩增109倍。最后可用凝胶电泳或探针杂交检测扩增的DNA。由于先将标本中的核酸特异成份扩增复制后再行检出,其敏感性较直接检测核酸大大提高[12]。PCR扩增的靶序列有3种:(1)主要外膜蛋白(MOMP)基因。(2)隐蔽性质粒基因。(3)rRNA基因。MOMP在每个Ct的拷贝数为1,因此扩增产物还可以用于Ct基因分型。隐蔽性质粒在 Ct中拷贝数为 10,敏感性比MOMP-PCR高。rRNA基因在Ct中含量较少,故敏感性较前两者低。除经典PCR和PT-PCR外,有几种特殊的PCR:(1)顺序释放酶(TETR)PCR;(2)猝灭剂标记的核酸探针(Q-DNA)PCR;(3)自动化PCR;(4)混合标本(pooling)PCR。许多研究都已表明,PCR较培养法和EIA法都要敏感[13],而且PCR对于有症状或无症状人群同样敏感。

4.4 PCR技术

4.4.1 PCR的基本成分 PCR反应所需的成分主要有模版DNA,一对核苷酸引物,缓冲液,四种三磷酸脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶以及一些离子。

模版:就是需要扩增序列的核苷酸,来源很广,几乎所有形式的DNA和RNA都能作为PCR反应的模版。

引物:是与靶DNA的3'端和5'端特异性结合的核苷酸片段,是决定PCR特异性的关键。

缓冲液:要维持PCR反应的pH,必须用到缓冲液,最常用的是10-50 mmol/L的 Tris-HCL,在PCR反应中,pH值变化于6.8-7.8之间。

三磷酸脱氧核苷酸:四种三磷酸脱氧核苷酸(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)是PCR反应的原料。一般商品化供应的dNTP溶液pH为7.0,各dNTP的浓度为2.5 mmol/L,一般使用浓度控制在 20-200 μ mol/L。四种各dNTP分子浓度必须相等,以减少错配。

耐热DNA聚合酶:耐热DNA聚合酶的发现,实现了PCR的自动化,能经受95℃以上的高温而不失活。

其他成分:二价Mg离子能活化DNA聚合酶;DMSO有利于DNA的变性;TMAC可去除非特异扩增,促进PCR;甘油有利于DNA复性,不过并不是对所有PCR都有利。

4.4.2 PCR的基本过程 以拟扩增的DNA分子为模版,首先高温变性,将混合物加热到94℃维持15到30秒,使模版DNA双链解旋成两条单链;然后逐渐降温退火,温度降到55℃,使引物与模版DNA单链的互补序列配对结合;最后在引物、DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模版链延伸直至完成新的DNA合成。如此循环20次原始DNA将扩增约106。经过扩增后的DNA产物多为介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片段。

4.4.3 荧光定量PCR技术 荧光定量PCR技术(Real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模版进行定量分析的方法。实时荧光PCR是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模版进行定量分析[14]。该技术不仅实现了PCR从定性到定量检测的飞跃,而且所有反应均在同一溶液中进行,不需任何后处理过程,具有特异性更强、有效解决PCR污染的问题、自动化程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准确性的特点[15]。

在荧光定量PCR反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化。从而得到一条荧光扩增曲线。荧光扩增曲线包括3个阶段:基线期,扩增期和平台期。只有在荧光信号扩增期,PCR产物量的对数值与起始模版量之间存在线性关系,所以可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较,在荧光定量PCR反应的指数期,需要设定一定荧光信号的阈值,一般这个阈值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本地信号,荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号,它可以用于定义样本的阈值循环数(Cycle Threshold,Ct)。每个模版的Ct值与该模版的起始拷贝数存在线性关系。在PCR过程中可以连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到荧光阈值时,Ct值被记录下来。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量PCR技术比起普通PCR,不用进行琼脂糖凝胶电泳,EB染色,人工分析数据等步骤。较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有很大的优势。它操作简便、快速高效,荧光定量PCR技术不仅具有普通PCR的高灵敏性,而且可以实时检测PCR每个循环过程中荧光信号的变化,并获得定量结果,具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性,可以降低污染,进行多重扩增,克服了普通PCR的许多不足。

20世纪50年代以前,沙眼曾在我国广泛流行,是当时致盲的首要病因,20世纪70年代后随着生活水平的提高、卫生常识的普及和医疗条件的改善,其发病率大大下降。沙眼患者往往缺乏典型的临床表现,如何能确诊沙眼就要更多的依赖于先进的实验室检查技术。这样才能更好的指导我们对早期及轻症沙眼患者进行规范化治疗,从而达到消灭沙眼的最终目标。

[1]Hammerschlag MR.The intracellular life of chlamydiae[J].Semin Pediatr Infect Dis,2002,13:239.

[2]Shaw JH,Grund VR,Durling L,et al.Expression of genes encoding Th1 cell-activating cytokines and lymphoid homing chemokines by chlamydiapulsed dendritic cells correlates with protective immunizing efficacy[J].Infect Immun,2001,69:4667.

[3]葛 坚,赵家良,崔 浩,等.眼科学[M].北京:人民卫生出版社,2005:160-161.

[4]Thylefors B,Dawson CR,Jones BR,et al.A simple system for the assessment of trachoma and its complications[J].Bull World Health Organ,1987,65:477.

[5]Anon National guide line for the management of balanitis Clinical Effectiveness GroupAssociation of Genitourinary Medicine and the Medical Society of the Study of Venereal Diseases[J].J Sex Transm Infec,1999,75(Supply):85.

[6]Schachter J.Chlamydia trachomatis.The more you look,the more you findhow much is there?[J].Sex Transm Dis,1998,65:485.

[7]Stephens RS,TamMR,Kuo CC,et al.Monoclonal antibodies to Chlamydia trachomatis:antibody specifics and antigen characterization[J].J Immunol,1982,128:1083.

[8]Chernesky M,Jang D,Copes D,et al.Comparison of a polymer conjugateenhanced enzyme immunoassay to ligase chain reaction for diagnosis of chlamydia trachomatis in endocervical swabs[J].J Clin Microbiol,2001,39(6):2306.

[9]Lauderdale TL,Landers L,Thorneycroft I,et al.Comparison of the PACE 2 assay,two amplification assay,and clearview EIA for detection of chlamydia trachomatis in female endocervical and urine specimens[J].J Clin Microbiol,1999,37(7):2223.

[10]Bobo L,Munoz B,Viscid R,et al.Diagnosis of Chlamydia trachomatis eye infection in Tanzania By polymerase chain reaction/enzyme immunoassay[J].Lancet,1991,338(5):847.

[11]Fan J,Zhang WH,Wu YY,et al.Detection of Infections of the eye with chlamydia trachomatisby the polymerase chain reaction[J].Int Ophthal,1993,17(6):327.

[12]Bailey RL,Hampton TJ,Hayes LJ,et al.Polymerase chain reaction for the detectionof ocular chlamydial infection in trachoma-endemic communities[J].J Infect Dis,1994,170(3):709.

[13]Allen SK,Semba RD.The trachoma“Menace” in the United States,1987-1960[J].Surv Ophthalmol,2002,47:500.

[14]Rajeevan MS,Ranamukhaarachchi DG,Vernon SD,et al.Methods,2001,25:443.

[15]Ke LD,Chen Z,Yung WK.Mol Cell Probes,2000,14(2):127.