大鼠体外循环模型研究进展

龙 翔,晏 浩,徐建军

自体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)技术上世纪 50年代运用于临床后,相关技术迅猛发展,但是围 CPB期有关病理生理、物理损害和血流动力学改变等尚有诸多不明确因素[1-6]。为了阐明这一病理生理学过程,许多学者作了相关研究,以往较多为大动物模型,如兔、狗、羊和猪等[7-11],但建立这些模型费用昂贵、技术要求高、管理不便以及难以长期生存,故发展受到限制。大鼠的循环系统和人类十分相似,而且管理方便、手术操作简便和易长期存活,故以大鼠为体外模型可以系统的研究体外循环围手术期病理生理改变机制。至今,关于大鼠体外循环模型的报道逐渐增加,且取得了长足的进步,现将大鼠体外循环模型研究现状做一综述。

1 研究历史

上个世纪 60年代,Popovic等[12]首先报道了低温大鼠体外循环模型,他们使用的装置包括:滚压泵、薄膜式氧合器、热交换器、滤泡器和静脉储血器等,血液由右心室通过重力作用引流,最后泵入颈动脉。整套系统的预充量为 13.7ml,其中氧合器占了 11.3m l。实验当中,他们首先将穿刺好血管通道的大鼠冷却到 14℃,然后连接好各管道进行低温(14.0±0.2)℃转机,之后大鼠体温升至 22℃停止转机,转机过程当中,采用“平衡灌注法”,将大鼠放在天平上,根据体重调节灌注流量。灌注流量最大为 32m l/(kg·min),低温时达到大鼠心输出量的80%,常温时达到 50%。75只实验大鼠大部分顺利脱机,但未报道长期生存。

之后,相继有一些学者研究大鼠体外循环模型,各有特色,但都由于灌注流量、预充量和长期生存等问题未得到解决,限制了其发展。其中 Triggiani等[13]采用开胸建立大鼠体外循环模型,提出了“三叉戟状”引流装置,三个分支分别引流大鼠的左、右上腔和下腔静脉,但是转机流量只有 15～20 ml/(kg·min),转机时间短,且脱机后存活时间短暂。Alxenade等[14]建立了转机时间较长(＞6 h)的大鼠体外循环模型,其特色是使用了旋转的盘型氧合器,预充量为 4.4m l,总预充量 12m l,预充液包括 Hartmnan溶液和肝素。其目标主要为检测 CPB过程中血红蛋白、红细胞比容等血液学指标,并未考虑大鼠存活。Wehberg等[15]为了研究体外循环中氧化亚氮调节体内各器官水潴留的作用开胸建立了流量较大[125 ml/(kg·min)]的大鼠体外模型,右心房引流,左室心尖至升主动脉根部的插管,但是预充量高达30ml,超过了大鼠的正常血量,所有大鼠均未存活。

2 研究现状

进入 21世纪后,大鼠体外循环模型相继报道,其主要特色在于全流量、预充量小甚至无血预充、低温或常温心脏停搏和长期生存。

2004年,Gua-Hua Dong等[16]报道了常温下全流量的大鼠体外循环长期存活模型,大鼠气管插管,机械通气,采用内径为 4 mm的静脉引流管连接置入右心房的穿刺管道引流静脉血,1.6mm内径的颈动脉灌注管道,流量可达到 100～150 ml/(kg·min)。转机过程中,保持平均动脉血压为 60～80 mmHg(1mmHg=0.133 kPa),大鼠的心率保持在210～280次/min。他们使用了特殊设计的专用动物膜肺,交换面积为 0.05 m2,预充量只有 4 Ml,血气分析的结果显示它完全可以满足 60 min的灌流需氧量。这个模型的总预充量为 16 ml(新鲜同种异体血液和胶体液各半),恰好为成年大鼠全身血量的一半,这和临床上的体外循环较为相似。实验结果显示,10只体外循环大鼠能够存活 2周以上。

Bettina Jungwirth等[17]为了研究深低温停循环技术后大脑损伤的机制,在 2005年建立了一种新的可长期存活的深低温停循环体外模型,采用 4.5 Fr的多侧孔静脉引流管道引流右心房静脉血,20 G穿刺管置入尾动脉灌注,体外循环初始流量达到160～180m l/(kg· min),随着降温(热交换器、冰袋和冰毯)流量逐渐减半,约半小时肛温下降到 16～18℃,大鼠心脏停搏,不同的停搏时间(0 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min)后大鼠复温 ,同时恢复体外循环,复温时间超过 40 min,肛温至少达到 35.5℃后停止转机。他们也采用了特制的膜式氧合器,预充为 4 Ml,交换面积为 558 cm2。在深低温停循环过程中,动物不行机械通气,但是,在转机过程中给予吸入氧分数为 0.21的持续气道正压通气,避免肺膨胀不全。此模型预充量减少到10 ml,而且无血预充(使用羟乙基淀粉)。在拔除血管插管后,大鼠仍然予机械通气 1小时,同时收集残留血液离心(2 000 r/min,10 min)后输入大鼠体内。大鼠恢复自主呼吸后,将其放置富含氧气的环境中12 h自由摄食、摄水。实验结果显示,大鼠的存活率和深低温停搏持续时间呈剂量负相关性。90 min组以下的大鼠基本存活到术后 14天。

Ralf Günzinger等[18]设计了大鼠开胸主动脉夹闭和心脏停搏的体外循环模型,这个模型也使用了一个特殊设计的膜式氧合器,它的交换面积相对较大为 0.063m2,预充量却很小为 4 ml,此外热交换器的预充量为 0.6ml,内径为4mm的12 cm长的灌注泵硅胶管道预充为 1.5ml,其他管道预充为 1m l,加上预留在静脉储血器中的 1 ml,总的预充量为 8 Ml,采用 4：1的羟乙基淀粉和碳酸氢钠。避免需要同种异体血液,这与临床实践相符。他们采用右颈静脉引流和右股动脉灌注,但为了监测左室收缩和舒张功能,在大鼠左右颈动脉和左颈静脉均插入了管道,转机前切开胸骨,阻断主动脉。通过一带负压装置的静脉储血槽,转机后流量可达到 120 ml/(kg·min),同时迅速将肛温降至 32℃,之后注入高钾晶体心脏停搏液,停搏 30m in后,主动脉开放,复温至 37℃。为了检测心肌肿瘤坏死因子-a(TNF-a),白介素(IL)-6 mRNA的水平,停机后 60 min就将大鼠处死。此模型作者主要是采用导管技术监测术中左心室收缩舒张功能和术后心肌组织 TNF-a,IL-6mRNA的水平,并未考虑长期存活。

Fellery de Lange等[19]在 2008年报道了闭胸主动脉阻断的大鼠体外循环和心脏停搏模型。此模型最大的特点是通过 B超引导置入主动脉瓣上方的双腔导管,其前端有一气囊,可充气膨大阻断主动脉,也可以通过此导管注射入心脏停搏液。而且他们采用腹壁尾侧浅动脉监测血压,减小了对大鼠的创伤。他们使用的膜式氧合器,预充量也为4 ml,交换面积为 558 cm2。整套系统共预充 10m l羟乙基淀粉。气管插管机械通气,右心房插管引流,尾动脉灌注。转机后保持 150 ml/(kg·min)的流量,15 min后将插入主动脉瓣上方导管的气囊注气膨大阻断主动脉,同时注射入适量心脏停搏液,让心脏停搏30min,停搏过程中通过热交换器保持体温在 34℃。之后将气囊抽空主动脉开放,恢复流量,而且复温至37℃。脱机后继续保持机械通气一小时,然后将大鼠放置在温暖和富含氧气的环境中复活。大鼠均存活 14天以上。本实验还有个特别之处:采用针状热敏电阻置入左侧颞肌下测量颅骨膜温度。此模型有诸多优点:创伤性小、容易存活、心脏停搏时间和体外循环转机时间的可控性。

3 建立稳定实用、接近临床的大鼠体外循环模型

3.1 氧合器和预充量 整个循环通路的预充量主要取决于氧合器。随着医疗科技的发展,氧合器已经从早期使用的鼓泡式过渡到了现在使用的膜式氧合器。早期使用的鼓泡式氧合器预充量太大,并不适合建立一个接近临床的动物模型。从目前各实验室使用的膜肺来看,其交换面积大约为 0.05m2,预充量为 4ml,这样循环通路总预充量可以控制在 10ml以内,使得无血预充得以实现,更加接近于临床。使用 100%的氧气在大鼠全流量[150～180 ml/(kg·min)]下,足以满足大鼠机体的需氧量,而且在没有行机械通气的情况下,仍然可以达到足够的氧合。

3.2 静脉引流和流量控制 静脉引流量的大小直接影响到流量的控制,也是模型成功的关键。不同的学者有不同的观点,前端多孔管道心房插管、多极管道引流、增加心房和储血槽的落差、虹吸作用和保持储血槽的负压都是增加静脉引流量的方法。成年大鼠的心输出量为 150～180m l/(kg·min),平均动脉血压为80mmHg以上。只有灌注流量达到 150 ml/(kg·min)以上才为真正意义上的全流量模型,以上只有 Bettina Jungwirth[17]等和 Fellery de Lange[19]等的模型达到此流量。但达到流量的同时要考虑血压的稳定和维持。此外,目前实现主动脉顺行灌注的最佳方法为颈动脉插管。照 Fellery de Lange[19]的插管方法,在颈动脉置入一根三腔多功能管,既可阻断主动脉又可向心脏注射入心脏停搏液,还可以进行灌注,不失为一种很好的办法。

3.3 心脏停搏 正中开胸、直接插管、主动脉夹闭和注射心脏停搏液,是临床心脏手术常规的步骤。此模型中,不可能追求与临床完全一致,Ralf Günzinger[18]等的模型除了直接插管外,基本采用临床模式,同时双侧颈动脉插管监测心脏功能,大鼠均未存活。Ralf Günzinger[18]等的深低温停循环技术和 Fellery de Lange[19]等的插管主动脉阻断、注射心脏停博液是目前最为实用的心脏停搏技术。但是,深低温停循环技术中缺乏完全有效的温度控制。后者也存在一些潜在的缺陷,动脉导管需精确地置于主动脉瓣旁。超声影像是必须的,当导管没有置于最佳位置,会造成不完全阻断,气囊可能会损害头壁干或者左心室。如果气囊注射过大,很可能造成左心室扩张。

3.4 术后存活 体外循环后大鼠的存活期,对研究CPB后机体的病理生理变化机制及探讨临床保护策略极其重要。目前大多数学者采用纤维喉镜辅助下的气管插管技术或直接插管法建立气道,避免了气管切开后带来的并发症问题[16-22]。此外不开胸利于大鼠转流后呼吸功能的恢复。转流中和转流后的血气、电解质的监测和调整也是存活的必要条件之一。创伤最小化、保持胸廓的完整性是使动物术后能够长期存活的重要条件,预充液量的大小对此也有较大影响。Bettina Jungwirth[18]等和 Fellery de Lange[19]等为了提高生存时间做了如下的处理:转流结束后继续机械通气一小时,同时将残留血液离心收集红细胞输入大鼠体内,大鼠恢复自主呼吸后将大鼠放置温度适宜、富含氧气的环境中让其自由摄食、摄水。

4 研究展望

理想的大鼠 CPB模型应该是操作简便、无血预充、主动脉顺行灌注、全流量、可控性强和存活时间长。Fellery de Lange[19]等的大鼠 CPB模型创伤性小、容易存活、心脏停搏时间和体外循环时间的可控性,似乎接近理想状态,但是临床上的正中开胸、心脏直接插管等常规步骤没有实施。我们的目标是追求一个理想的和临床大致相似的大鼠 CPB模型装置,但是正中开胸,直接插管等必然会明显降低大鼠存活率。为解决这一矛盾,随着医疗科技的发展,我们可以进一步改进循环通路各元件,进一步改良设计各插管途径甚至开胸路径,根据自己科研的需要设计出简单合理实用的理想的大鼠 CPB模型。

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