基于肽抗原的间接酶联免疫吸附法检测抗水通道蛋白4抗体在神经精神狼疮中的临床意义

曹芸 陆晓晔 陈晓翔 钱洁 赵江峰 顾越英 叶霜

(上海交通大学医学院附属仁济医院检验科,*风湿病科,上海 200001)

抗水通道蛋白4(aquaporin 4,AQ-4)抗体在慢性脱髓鞘病变,如视神经脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)、多发性硬化(multiple sclerosis,MS)等中已被检出,在自身免疫病干燥综合征(Sjogren syndrome,SS)中也被检出[1-2]。Mehta等[3]报道了1例抗磷脂综合征合并视神经脊髓炎的患者,由于脱髓鞘病变和横贯性脊髓炎是系统性红斑狼疮(SLE)常见的神经系统并发症,且SLE患者有大量的自身抗体,故我们推测在神经精神狼疮患者中也能检出抗AQ-4抗体,并对神经损害起作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选自上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科住院患者;49例健康对照者来自作体检的本院职工,其中男性4例,女性45例,平均年龄35±9.9岁。54例其他风湿病患者中包括32例多肌炎/皮肌炎,10例干燥综合征和12例类风湿关节炎患者,其中男性6例,女性48例,平均年龄36±9.7岁。105例SLE无神经系统累及患者,其中男性9例,女性96例,平均年龄37±6.8岁。103例神经精神狼疮(NPSLE)患者,其中男性7例,女性96例,平均年龄38±8.3岁。

22例非风湿病神经疾病(非视神经脊髓炎和多发性硬化患者)(男性 2例,女性 20例,平均年龄35±8岁)、31例SLE发热无神经系统累及患者(男性2例,女性29例,平均年龄37±7岁)、96例NPSLE(男性7例,女性 89例,平均年龄 36±9岁)、27例合并结核感染及8例合并隐球菌脑膜炎的SLE患者(均为女性)检测了脑脊液检测抗AQ-4抗体。所有自身免疫病患者均符合各自的诊断分类标准;结核感染依据临床表现和实验室结核菌培养;隐球菌感染根据细菌学培养、墨汁染色和乳胶凝集试验。

1.2 AQ-4抗原肽 由于AQ-4分子是6次跨膜蛋白,有3段短肽在细胞膜外,故我们通过上海华大天源生物科技公司合成了3段肽,第1段AQP4-56-69的序列为CTINWGGTEKPLPVD,第2段AQP4-136-153的序列为 CVTPPSVVGGLGVTMVHGN,第3段AQ4-212-230的氨基酸序列为CMNPARSFGPAVIMGNWENH。

1.3 间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗AQ-4抗体 3段肽各500 ng◦mL-1混合溶解在0.05 mol◦L-1的碳酸缓冲液中,4℃过夜。磷酸缓冲液(PBS)洗板3次,0.1%明胶封闭2 h候后,PBS再洗板3次,再加入100μL脑脊液或1∶100稀释的外周血清,37℃反应1 h,PBS-T洗板3次,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(1∶10000),洗板后加入TMB显色液反应10min后用2 mol◦L-1硫酸终止。

1.4 统计学分析 使用SPSS12.0分析软件,方差分析统计各组之间的差异。

2 结 果

2.1 血清抗AQ-4抗体检测 按照ELISA计算常规,以健康人(对照组)的平均吸光度(OD)+3标准差(SD)为临界值,血清标本阳性率在对照组为0%;其他风湿病组阳性率为1.8%(1/54);SLE组为14.3%(15/105);NPSLE组为22.3%(23/103)。

2.2 脑脊液抗AQ-4抗体检测 脑脊液检出阳性率在对照组为0%;SLE组为12.9%(4/31);NPSLE组为29.2%(28/96);SLE合并结核性脑膜炎者为37%(10/27);SLE合并隐球菌脑膜炎者为0%(0/8)。

2.3 SLE组和NPSLE组患者的血清和脑脊液中的抗AQ-4抗体显著增加(P＜0.01),SLE组血清和脑脊液中的抗AQ-4抗体水平相似(P＞0.05)。NPSLE组脑脊液中抗体检出率(29.2%)较血清中抗体检出率(22.3%)增高(P＜0.01)。SLE合并TB组脑脊液抗AQ-4抗体的检出率显著增高(P＜0.01)。

3 讨 论

AQ-4是一种通道蛋白,主要表达在神经星型细胞末端的血脑屏障、朗维埃结节和跨神经突触,参与水、钾离子和谷氨酸的转运。我们发现AQ-4是一种6次跨膜蛋白,其在胞外段的氨基酸序列均较短,故为我们设计基于肽抗原的间接ELISA检测方法成为可能。通过抗原分析,我们将AQ-4的A环的氨基酸序列CTINWGGTEKPLPVD(AA56-69)、B环的氨基酸序列CVTPPSVVGGLGVTMVHGN(136-153)和 C环的氨基酸序列 CMNPARSFGPAVIMGNWENH(212-230)设计为抗原肽。混合包板,建立基于肽抗原的ELISA检测方法,以方便检测SLE患者血清和脑脊液中的抗AQ-4抗体。

在血清学检测中,抗AQ-4抗体在其他风湿病组阳性率为1.8%,在SLE组为14.3%,在NPSLE组为22.3%。在脑脊液组中,对照组为0%,SLE组为12.9%,NPSLE组为29.2%,SLE合并结核性脑膜炎者为37%,SLE合并隐球菌脑膜炎者为0%。可见SLE组和NPSLE组患者的血清和脑脊液中的抗AQ-4抗体显著增加(P＜0.01),SLE组血清和脑脊液中的抗AQ-4抗体水平相似(P＞0.05)。但NPSLE组脑脊液中抗体检出率(29.2%)较血清中抗体检出率(22.3%)增高(P＜0.01)。尤其在SLE合并结核组的脑脊液中,抗AQ-4抗体的检出率显著增高(P＜0.01),结合AQ-4本身的功能,抗AQ-4抗体可能使血脑屏障破坏,因而导致了SLE患者结核感染的概率增加。Sellner等[4]对感染相关的视神经脊髓炎进行了分析,发现与结核感染相关的视神经病变显著增加。因此,本研究的发现提示抗AQ-4抗体是感染与自身免疫之间潜在的桥梁。

我们没有比较重组AQ-4抗原检测结果和肽抗原检测结果的相关性,但以肽段为抗原的检测结果已经提示抗AQ-4抗体与NPSLE的相关性。基于我们[5]以往的经验,相信这种检测方法将会广泛应用于临床。

1 Lennon VA,Kryzer TJ,Pittock SJ,et al.IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquapo rin-4 water channel[J].J Ex p Med,2005,202(4):473-477.

2 min JH,Kim HJ,Kim BJ,et al.Brain abnormalities in Sjog ren syndrome with recurrent CNS manifestations:association with neuromyelitis optica[J].Mult Scler,2009,15(9):1069-1076.

3 M ehta LR,Samuelsson MK,Kleiner AK,et al.Neuromyelitis optica spectrum disorder in a patient with sy stemic lupus ery thematosus and anti-phospholipid antibody syndrome[J].Mult Scler,2008,14(3):425-427.

4 Sellner J,Hemmer B,Mühlau M.T he clinical spectrum and immunobiology of parainfectious neuromyelitis optica(Devic)syndromes[J].J Autoimmun,2010,34(4):371-379.

5 叶萍,许桂芳,陈晓翔,等.肽抗原 ELISA检测系统性红斑狼疮患者抗核糖体蛋白 P抗体的临床意义[J].中华风湿病学杂志,2006,10:73-76.