煎煮方式对甘草次酸家犬体内药动学影响

王 立， 赵 瑛

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150076;2.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨150076)

葛根芩连汤为张仲景名方，该方由葛根、黄连、黄芩和炙甘草组成，其中甘草具有一定的解毒、抗病毒、抗溃疡等作用，其主要成分为甘草酸、甘草次酸等［1］。中药提取工艺的差异往往导致其制剂临床疗效差别很大。由于甘草酸胃肠道给药后在血液中很难检测到［2，3］，因此，本实验通过测定灌服葛根芩连汤全方及单方煎液的家犬体内甘草次酸体内经时过程，分析相应的药动学参数，探讨煎煮方式对甘草次酸家犬体内药动学的影响，以期对生产实践提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

Dinex高效液相色谱仪(P680泵，ASI-100自动进样器，TCC-100柱温箱，UVD-340U二极管阵列检测，Chromeleon色谱工作站);XKG6-A型快速混合器(姜堰市新康医疗器械有限公司);TGL-16G型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 药品与试剂

甘草次酸对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号:A0038)，卡马西平(哈尔滨商业大学药物化学教研室提供)，乙腈(色谱纯)，其他试剂为分析纯。葛根，黄芩，黄连，炙甘草(哈尔滨人和药店)。

1.3 样品制备

葛根芩连汤煎剂(T):按处方配比取葛根芩连汤各味药的饮片(葛根15 g，黄芩9 g，黄连9 g，炙甘草6 g)5份，加水2 000 mL，先煎葛根20 min，余药共煎30min，煎2次，合并煎液，定容1 000 mL，浓缩至200 mL，备用。

甘草单煎液(S):取炙甘草饮片30 g，加水2 000 mL，投入药材煎30 min，煎2次，合并煎液定容至1 000 mL浓缩至200 mL，备用。

1.4 实验动物

健康家犬12只，♀♂不限，体重(14±2.3)kg，沈阳军区总医院实验动物科提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:UltimateTM C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱温:30℃;流动相:乙腈-体积分数为0.5%冰醋酸水溶液(42:58，V/V);流速:1.0 mL/min;检测波长254 nm。

2.2 方法专属性考察

在本实验所采用的色谱条件下，甘草次酸的保留时间在6.2 min左右，内标卡马西平的保留时间在3.7 min左右，峰形良好，血清中其他成分干扰测定，具有较高的特异性，相关色谱图见图1。

图1 家犬血清中GA的HPLC图A.空白血清 B.空白血清中甘草次酸和内标 C.家犬灌服甘草单煎液后血清样品图 D.家犬灌服T后血清样品图 1.卡马西平2.甘草次酸Fig.1 HPLC Chromatograms of GA in serumA.blank serum B.blank serum spiked with GA and internal standard C.serum sample after administration of decoction S to dogs D.serum sample after administration of decoction T to dogs 1.carbamazepine 2.glycyrrhetinic acid

2.3 血样采集

12只家犬随机分为两组，每组各6只，给药前12 h禁食过夜，于次日早晨空腹分别插管灌胃给予T及S溶液200 mL(相当于甘草原药30 g)。于服药前和服药后 1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、36 h 分别于股静脉取血5 mL，置塑料离心试管中离心分离血清置于－25℃冰冻保存备用。

2.4 血样处理［4，5］

取1.5 mL血清置具塞玻璃离心试管中，加入内标液20 μL涡旋混合2 min;加入5 mL氯仿涡旋混合5 min，3 500 r/min离心10 min，取有机层4 mL置试管中50℃水浴条件下氮气吹干。残渣以200 μL流动相溶解，15 000 r/min离心10 min，取上清液20 μL进样。

2.5 标准曲线制备

精密称取甘草次酸对照品10.0 mg至10 mL量瓶中，以溶剂H(乙腈:水=8:2，V/V)定容至刻度，得贮备液。贮备液以溶剂H分别稀释得质量浓度为7.5、15、30、60、120 和240 μg/mL 系列工作液，分别取上述工作液10 μL于离心试管中加入家犬血清1.5 mL蜗旋混合2 min后加入内标液20 μL涡旋混合2 min;得浓度分别为 50、100、200、400、800 和1 600 ng/mL的含药血清，按“2.4”项下处理、测定，以峰面积比A对质量浓度C(ng/mL)作加权线性回归(W=1/C2)，得方程为:A=0.012 C+0.027，r=0.999 5，血浆中甘草次酸浓度在范围50～1 600 ng/mL间与峰面积比线性关系良好，最低定量浓度为50 ng/mL。

2.6 精密度实验

配制低、中、高 3种质量浓度(100、400、1 500 ng/mL)的标准血样，相同方法处理后进样，由标准曲线计算出质量浓度，计算日内、日间精密度。结果见表1。

表1 甘草次酸日内与日间精密度(n=5)Tab.1 Inter-day and intra-day precision of GA in dog serum

2.7 回收率实验

配制低、中、高 3种质量浓度(100、400、1 500 ng/mL)的标准血样，按“2.4”项处理后进样，同时以相应浓度对照品溶液直接进样，将两组峰面积进行比较计算绝对回收率，低、中、高浓度的绝对回收率分别为(85.3±4.5)%、(84.6±3.9)%和(84.2±3.4)%(n=6)。内标绝对回收率为(74.2±3.7)%(n=18)。

2.8 药-时曲线

两组家犬灌服T、S溶液后，甘草次酸平均血药浓度-时间曲线见图2。

2.9 药动学参数

家犬灌服葛根芩连汤煎剂和甘草单煎液后，药动学参数采用非隔室模型处理，Cmax和tmax以实测值表示，以末端相若干点血药浓度的对数值对时间进行回归，求得末端消除速率常数λZ及消除半衰期t1/2;运用梯形面积法计算药-时曲线下面积AUC0～t;AUC0～∞=AUC0～t+Ct/λZ。计算结果见表 2。

图2 家犬灌服T、S溶液后甘草次酸的平均药时曲线Fig.2 Mean serum concentration-time curve of GA after administration of decoction T and S to dogs

表2 甘草次酸家犬体内药动学参数(n=6，±s)Tab.2 Parameters of GA in dogs after administration of decoction T and S(n=6，±s)

表2 甘草次酸家犬体内药动学参数(n=6，±s)Tab.2 Parameters of GA in dogs after administration of decoction T and S(n=6，±s)

参数 单位 甘草单煎液 葛根芩连汤λZ h－1 13 214±6 327 6 589±1 450 0.097±0.022 0.047±0.014 Cmax ng·mL－1 986.5±116.9 244.8±56.1 tmax h 10.3±1.5 9.7±1.5 t1/2 h 7.4±1.6 15.8±4.3 MRT0-36 h 16.7±1.7 28.3±4.8 MAT0-36 h 2.7±0.9 5.3±0.8 AUC0-36 ng·(h·mL－1)14 483±2 410 4 766±963 AUC0-∞ ng·(h·mL－1)

3 讨论

体内样品分析中，样品的处理是一个关键步骤，其好坏直接影响后续实验的进行。由于涉及到后续实验，因此，在参考相关文献［4-6］的基础上，选择血清为分析样品，采用有机溶剂萃取的方法，处理甘草次酸血清样品。实验结果表明，本实验所采用的方法可靠，适用于甘草次酸家犬体内药物动力学实验。

家犬灌胃服用葛根芩连汤和甘草单煎液后，其体内甘草次酸药物动力学参数有明显差别，服用T与S相比，甘草次酸的消除半衰期明显延长;配伍后甘草次酸在家犬体内AUC降低，而达峰时间没有明显差异;这说明配伍后，甘草次酸家犬体内入血量降低，清除速率减慢，而方中其他组分的存在并不影响其在体内的达峰时间。至于出现这一结果的原因是方中哪一种成分的单独作用还是哪几种成分的协同影响以及如何影响，将在后续实验中分别详细考察。

［1］田圣志，赖宝林，施钧翰，等.甘草解毒作用研究进展［J］.世界中西医结合杂志，2008，3(9):560.

［2］Raggi MA，Maffei F，Bugamelli F，et al.Bioavailability of glycyrrhizin and licorice extract in rat and human plasma as detected by a HPLC method［J］.Pharmazie，1994，49(4):269.

［3］Shibata N，ShimokawaT，Jiang Z，et al.Characteristics of intestinal absorption and disposition of glycyrrhizin in mice［J］.Biopharm Drug Disposit，2000，21(3):95.

［4］田 娟，周彦彬，左 英，等.HPLC-MS-MS测定血浆中的甘草次酸及生物利用度［J］.中南药学，2007，5(5):476.

［5］赵文静，王本杰，魏春敏，等.高效液相色谱-质谱法测定人血浆中甘草次酸浓度及人体药代动力学研究［J］.山东大学学报(医学版)，2008，46(11):1111.

［6］陆 洋，李 娟，杜守颖，等.甘草次酸在大鼠体内药动学的RP-HPLC 研究［J］.中国中药杂志，2008，33(11):1294.