一种快速的leptinob和leptinrdb等位基因SNP分型方法

胡培丽,王金恒,岳秉飞

（中国药品生物制品检定所,北京 100050）

一种快速的leptinob和leptinrdb等位基因SNP分型方法

胡培丽,王金恒,岳秉飞

（中国药品生物制品检定所,北京 100050）

目的建立leptinob和leptinrdb等位基因的SNP分型方法-单管双向等位基因专一性扩增（single-tube bi-directional allele specific amp lification,SB-ASA）,同时与传统的PCR-酶切法进行比较分析。方法用PCR-酶切法和SB-ASA方法同时对ob/+杂合小鼠的7只后代小鼠和db/m的9只后代小鼠进行了检测分型。结果两种方法都成功地对ob、db小鼠进行了分型,且结果完全一致。结论成功建立了一种快速的leptinob和leptinrdb等位基因的SNP分型方法-SB-ASA,促进了ob、db小鼠的繁殖育种工作。

ob；db；SNP；单管双向等位基因专一性扩增；小鼠

瘦素（lep tin）是一种由167个氨基酸残基组成,分子质量16 000道尔顿的蛋白质激素,主要在白色脂肪细胞中表达,与细胞表面受体结合引发各种生理反应。瘦素通过与下丘脑相关的反馈环实现调节摄食、能量消耗及维持体重恒定。1994年,Zhang等[1]克隆了人和小鼠的肥胖基因（obese gene,ob gene）,其编码产物即为瘦素。ob/ob小鼠由于其ob基因在第105位发生由C→T的突变,使该位点的精氨酸密码子CGA转变为终止密码子TGA。这种突变使ob基因表达产物活性丧失,所以表现为肥胖。ob/ob小鼠广泛应用于肥胖症和糖尿病研究,是整个Jackson实验室中应用最多的肥胖动物模型,还广泛应用于营养学和药理学研究中的肥胖症和糖尿病治疗[2]。

1966年Humm el等[3]发现与ob/ob小鼠表型相似的db/db小鼠,30年后被证实是因为编码瘦素受体（lep tin recep tor,LR或ob-R）的糖尿病基因（d iabetes gene,db gene）胞内区外显子内一个G→T的点突变,而转录成胞内部分较短的无功能LR产物,失去将信号传至胞内的作用,表现为严重肥胖、瘦素抵抗、高瘦素血症、胰岛素抵抗和家族性糖尿病等[4-6]。db/db小鼠是 Lep tin受体基因缺陷导致的先天肥胖性 2型糖尿病小鼠,具有高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等特性。其发病过程与人 2型糖尿病肾病非常相似,是国际上广为采用的研究糖尿病肾病的动物模型[7,8]。

目前,Jackson实验室野生型和突变型等位基因的分型方法主要是用限制性内切酶消化基因组DNA的 PCR扩增产物,然后琼脂糖凝胶电泳鉴别[9,10]。该方法需长时间的酶切过程,整个过程约需 12 h,其中手工操作约有 1 h。本文我们用 PCR-酶切法和已成功建立的 SNP分型方法——单管双向等位基因专一性扩增[11](single-tube bi-directional allele specific amp lification,SB-ASA)检测leptinob和leptinrdb等位基因,并对该两种方法进行比较分析,拟建立一种快速的leptinob和leptinrdb等位基因的SNP分型方法,从而有效促进 ob、db小鼠的繁殖育种工作。

1 材料和方法

1.1 动物来源、饲养及DNA样品

B6.V-Lepob/+、B6.BKS(D)-Lep rdb/m杂合小鼠从南京模式动物研究所引进,合格证号：2002810。分笼饲养于无菌包中,自由摄食,饮水,近亲交配,成功繁殖。ob、db代表肥胖和糖尿病基因, m代表浅色毛基因,ob/+、db/m型为糖尿病和肥胖基因携带者,其表型正常,产生的后代中,25%发生糖尿病和肥胖,即 ob/ob、db/db型糖尿病鼠;25%为野生型,未发生任何突变;50%为杂合子,可用于繁殖交配。小鼠出生约 4周时剪取尾巴 1 cm长左右,用酚：氯仿抽提法提取基因组DNA。

1.2 试剂

DNA聚合酶等 PCR试剂均购自 Takara(宝生物,大连),限制性内切酶D deⅠ和RsaⅠ,购自Prom ega公司。

1.3 PCR-酶切法鉴别lep tinob和lep tin rdb等位基因

B6.V-Lepob/J小鼠 ob基因第 105位密码子处CGT→TGA单碱基突变,致使终止密码子替代了正常编码的精氨酸,基因组中的突变位点(C→T)形成DdeⅠ内切酶的酶切位点 (C^TNAG),分析其序列发现该位点两端还有 2个 DdeⅠ酶切位点,两端间距离为 155 bp,与 C/T突变点距离分别为 55 bp、100 bp。PCR扩增基因组DNA的这段目的基因片段 155 bp,引物序 列为IMR1151：5′-TgTCCAAgATgg ACCAgACTC-3′,IMR1152：5′-ACTggTCTgAgg CAgggAgCA-3′。PCR反应体系为：20μmo l/L引物0.4μL,10×PCR buffer 1.5μL、2.5 mmo l/L dNTP 1.0μL,5 U/μL DNATaq聚合酶 0.1μL、DNA模板10～50 ng,无菌超纯水补充体积至 15μL。PCR反应程序为：94℃3m in,94℃30 s,62℃1 m in,72℃45 s,35个循环,72℃延伸 2m in,4℃保存。PCR产物目的片段155 bp再经DdeⅠ酶切,酶切体系为：10 ×buffer2.0μL,10μg/μL BSA 0.2μL,DdeⅠ0.5 μL,5.0μL PCR产物,无菌超纯水补充体积至 20 μL;37℃,8 h。酶切产物经 3%凝胶电泳,根据条带类型鉴别各小鼠表型。

B 6.BKS(D)-Lep rdb/J小鼠由于编码瘦素受体的糖尿病基因 (diabetes gene,db gene)胞内区外显子内发生 G→T点突变,设计引物时 SNP位点一端的第二位引入错配碱基,形成 Rsa?酶切位点 (GT^ AC)。引物序列为IMR0985：5′-AgAACggACA CTCTTTgAAgTCTC-3′,IMR0986：5′-CATTCAAACC ATAgTTTAggTTTgTgT-3′(g为错配碱基),扩增片段长度为 135 bp。PCR反应体系同上,反应程序为：94℃1.5m in,94℃30 s,52℃45 s,72℃45 s,35个循环,72℃延伸2m in,4℃保存。PCR产物目的片段135 bp再经 RsaⅠ酶切,酶切体系为：10×buffer2.0 μL,10μg/μL BSA 0.2μL,RsaⅠ0.5μL,5.0μL PCR产物,无菌超纯水补充体积至 20μL;37℃,8 h。酶切产物经 3%凝胶电泳,根据条带类型鉴别各小鼠表型。

1.4 SB-ASA方法检测lep tinob和lep tin rdb等位基因

用已成功建立的单管双向等位基因专一性扩增[11](single-tube bi-directional allele specific am p lification,SB-ASA)方法检测糖尿病小鼠基因组DNA中的 SNP位点突变类型,从而确定各小鼠表型。引物 P1、P2扩增含 SNP突变位点的基因片段作为内对照,SNP1、SNP2为对应于不同等位基因的特异引物,3′末端对应于 SNP位点;为提高特异性,在其 3′端倒数第 3位引入错配碱基。各扩增片段和引物序列见表1。PCR反应体系为：20μmo l/L P1 (P2)0.5μL,20μmo l/L SNP1(SNP2)0.75μL,10× PCR buffer2.5μL、2.5mmo l/L dNTP 2.0μL,5 U/ μL DNATaq HS酶 0.15μL、DNA模板 20～100 ng,无菌超纯水补充体积至 25μL。PCR反应程序为：94℃ 4 m in,94℃ 45 s,退火温度 (leptinob62℃,leptinrdb55.5℃）45 s,72℃2m in,30个循环,72℃延伸 5m in,4℃保存。PCR产物经 1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,根据条带类型判断各小鼠表型。

表1 leptinob和leptinrdb等位基因SB-ASA分型的引物序列及扩增片段长度Tab.1 The p rim er sequences and amp lified fragm ent length of the leptinob and leptinrdb allele genotyped by SB-ASA.

2 结果

段落 true="1">

2.1 PCR

-

酶切法分型结果

ob/+杂合子交配产生的7只小鼠基因组DNA首先PCR扩增目的基因片段155 bp,再经DdeⅠ酶切,结果如图1-A所示：1、3、4、5、6号目的片段155 bp部分被DdeⅠ酶切,形成155 bp、100 bp、55 bp三条电泳条带,为ob/+杂合小鼠；2号目的片段未被DdeⅠ酶切,只有一条155 bp条带,说明该鼠ob基因第105位密码子没有发生突变,为+/+野生小鼠；7号目的片段完全被DdeⅠ酶切,形成100 bp、55 bp两条带,为ob/ob突变小鼠。

db/m杂合子交配产生的9只小鼠因组DNA首先PCR扩增目的基因片段135 bp,再经RsaⅠ酶切,结果如图1-B所示：1、2、6、7号目的基因片段135 bp部分被RsaⅠ酶切,形成135 bp、108 bp、27 bp（太小,在图中看不见）条带,为杂合型（db/m）；3、5、8号仅为135 bp条带,目的片段未被酶切,为野生型（m/m）；4、9号只有108 bp酶切片段,为突变型（db/db）,还有一条酶切片段27 bp由于太小,在此图中看不见。

2.2 SB-ASA方法分型结果

用 SB-ASA方法对7只ob/+杂合子后代和9只db/m后代小鼠进行了分型,结果见图 2。目的条带很清晰,虽然存在一些错配杂带,但不影响小鼠表型的鉴定。ob、db小鼠都扩增出 3条目的片段,即一条所有表型小鼠都有的片段,由引物P1、P2扩增而得,起内对照的作用；两条特征片段,分别对应于不同的SNP位点等位基因,根据不同的特征片段确定各小鼠的表型。7只 ob/+杂合子后代的检测结果为（图2-A）：1、3、4、5、6号小鼠除了内对照片段 489 bp,扩增出两条特征条带191 bp和342 bp, SNP位点为 T/C,为杂合型；2号特征条带为191bp,对应于等位基因 C,为野生型；7号的特征片段为342 bp,对应于等位基因 T,为突变型。9只db/m杂合子后代小鼠的检测结果为 （图2-B）：1、2、6、7号小鼠除内对照片段606 bp外,扩增出两条特征片段,474 bp和 150 bp,对应于等位基因 T/C,为杂合型；3、5、8号小鼠的特征片段为 150 bp,对应于等位基因G,为野生型；4、9号小鼠的特征片段为474 bp,对应于等位基因T,为突变型。所有小鼠的分型结果与PCR-酶切法的结果一致,说明SB-ASA方法是准确的、可靠的。

图1 leptinob和leptinrdb等位基因PCR-酶切法分型结果Note：M：20 bp DNA ladderm arker； Fig.1A：the genotyp ing resu ltsof seven offsp ringsof ob/+heterozygousm ice：1,3,4,5,6 w ere ob/+, 2 w as+/+,7 wasob/ob；Fig.1B：the geno typ ing resu ltsof nine offsp ringsof db/m heterozygousm ice：1,2,6,7 were db/m；3,5,8 w erem/ m；4,9 w ere db/db.F ig.1 The geno typ ing resu ltsof PCR-restriction endonuc lease d igestion fo r the leptinob and leptinrdb alleles

图2 leptinob和leptinrdb等位基因SB-ASA方法分型结果Note：M：20 bp DNA ladderm arker； Fig.2A：the geno typ ing resu ltsof seven offsp ringsof ob/+heterozygousm ice：1,3,4,5,6 w ere ob/+,2 was+/+,7 w asob/ob； Fig.2B：the genotyp ing resu ltsof nine offsp ringsof db/m heterozygousm ice：1,2,6,7 were db/m；3,5,8 w erem/m； 4,9 were db/db.F ig.2 The geno typ ing resu ltsof SB-ASA fo r the leptinob and leptinrdb alleles

3 讨论

PCR酶切法鉴定SNP位点等位基因是Jackson实验室目前用于鉴别ob、db小鼠不同表型的方法。通过创造酶切位点法检测单碱基突变,很多时候应考虑到限制性内切酶是否存在、是否易得、价格是否昂贵等问题,扩增的片段长度也不宜过长,而且片段间大小差距较小,琼脂糖凝胶电泳鉴别时有些困难,一些片段太小以致看不见条带。此外,酶切反应体系中PCR模板的量的优化也尤为重要,过多酶切不完全影响结果判定,过少电泳条带太浅结果无法鉴别。

SB-ASA方法仅需一次PCR扩增和一次琼脂糖凝胶电泳即可达到分型的目的。它快速、简单而且成本低廉,是一项开展SNP分型研究的十分有效的方法。此方法在特异性引物的3′端区域人为引入一个错配碱基,使得引物延伸的特异性大大提高,降低了SNP分析的假阳性率；同时在进行SNP分型时,采用热启动Taq酶和冰上操作,也可有效地控制假阳性现象。当然SB-ASA也有些不足：由于两对引物同时加入PCR反应体系,扩增过程中会有杂带产生,可通过优化退火温度得到改善。

此外,还可以根据毛色和体型的差别鉴别不同表型的db小鼠,节约了大量的时间和成本,方便了繁殖育种工作。由于db代表肥胖和糖尿病基因,m代表浅色毛基因,db/db、db/m小鼠毛色均为黑色,但db/db小鼠在4周时已明显肥胖,杂合子db/m可以根据体型很容易地挑选出来用于繁殖育种；而m/m野生型小鼠由于m代表浅色毛基因,毛色为灰色（m isty）。

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A Rap id SNP Genotype Assay for the leptinoband leptin rdbAlleles

O b jectiveTo establish a rap id SNP geno type assay fo r theleptinobandleptinrdballeles（single-tube bidirectional allele specific amp lification（SB-ASA）,and compared it w ith the traditionalm ethod of PCR-restriction endonuc lease digestion.M ethodsSeven and nine offsp ringsof ob/+and db/m heterozygousm ice,respectively,were genotyped by both the SB-ASA and PCR-restriction endonuc lease digestion.Resu ltsA ll the offsp ringswere successfully genotyped by both the two m ethods,and the resultswere identical.Conclusion sA rap id SNP genotype assay fo r theleptinobandleptinrdballeles has been successfully estab lished.Itm ay effectively p romo te the b reed ingwo rk of bo th the ob and dbm ice.

ob；db；SNP；single-tube bi-directional allele specific amp lification；mouse

An Overview on the M anagem ent of Laboratory M ouse Colonies

Sonja T.Chou （Charles River Preclinical Services，Shanghai201203，China）

R-33

A

1671-7856（2010）02-0054-04

胡培丽（1981-）,女,硕士研究生,研究方向：免疫遗传检测。E-m ail：hupeili-1981@163.com,电话：010-67639117。

岳秉飞（1960-）,男,研究员,博士。研究方向：动物遗传学。E-m ail：yue-bingfei@nicpbp.org.cn,电话：010-67095401。

HU Pei-li,WANG Jin-heng,YUEB ing-fei

（National Institute for the Contro lof Pharm aceu tical and B io logical Products,Beijing 100050,China）

2009-11-10

专家论坛

【Abstract】Two lectures covering the management of laboratory mouse colonies were presented in November at the laboratory animalmedicine technical training seminars sponsored by the Chinese Association for Laboratory Animal Sciences in Xi’an.Topics covered include troubleshooting mouse reproductive performance and managing genetically engineered colonies.The purpose of this article is to highlight the materials covered and to offer references for further reading.It is advised that references cited in this article be reviewed for a more comprehensive coverage on the topics presented.Please also note that the princip les for breeding practice and genetic management of outbred m ice were not covered，but the author may be contacted for a list of suggested reading materials.

【Key words】M ice；Breeding colony；Management；Production

［Chinese Library Classification］R332 ［Docum en t code］A ［A rticle ID］1671-7856（2011）01-0005-07

10.3969/j.issn.1671-7856.2011.01.002