精子发生障碍患者Y染色体微缺失的检测

孔琳，潘伯臣，杜强，杨大磊

（中国医科大学 附属盛京医院妇产科生殖中心，沈阳 110004）

精子发生障碍患者Y染色体微缺失的检测

孔琳，潘伯臣，杜强，杨大磊

（中国医科大学 附属盛京医院妇产科生殖中心，沈阳 110004）

目的 探讨Y染色体微缺失与精子发生障碍患者染色体核型、临床表型、性激素水平等因素的关系。方法 采用多重PCR技术检测42例非梗阻性无精子症及39例严重少精子症患者的SRY基因、ZFY基因及AZFa、AZFb和AZFc3个区域的6个序列标签位点。结果 81例非梗阻性无精子症及严重少精子症患者中发现了10例微缺失，发生率12.35%，其中非梗阻性无精子症患者6例，严重少精子症患者4例；10例微缺失患者中，1例为AZFa+AZFb+AZFc区缺失，2例为AZFb+AZFc区缺失，1例为AZFb区缺失，6例为AZFc区缺失。结论 Y染色体长臂微缺失与精子发生障碍相关，有必要对非梗阻性无精子症及严重少精子症患者进行Y染色体微缺失检测。

男性不育；无精子因子；Y染色体微缺失；多重聚合酶链反应；无精子症；严重少精子症

全世界大约有15%的夫妇不育，其中男性不育约占40%～50%，因此男性不育越来越引起广泛重视［1］。精子发生障碍是男性不育的一个重要病因，可由多方面因素引起，例如疾病、内分泌紊乱、遗传因素、环境因素等。但目前大约60%患者中睾丸生精功能下降的原因人们还未确切了解。

近十几年来的研究表明，Y染色体上存在着一些精子发生调控基因，即无精子因子（azoospermia factor，AZF），AZF缺失引起的生精障碍是导致男性不育的重要原因。本研究采用多重PCR，对非梗阻性无精子症和重度少精子症患者进行Y染色体微缺失检测，分析AZF缺失类型与患者临床表型之间的关系，以期为AZF缺失相关男性不育的临床诊断和治疗提供有益资料和指导。

1 材料与方法

1.1 研究对象

81例患者均为2006年3月至2007年10月于中国医科大学附属盛京医院辅助生殖中心门诊就诊的患者，年龄23～40岁。详细了解患者有无睾丸炎、腮腺炎、精索静脉曲张等病史，排除梗阻性无精子症，所有患者均无有毒物质及放射线接触史。按WHO（1999）的诊断标准，进行2次以上的精液常规分析，将患者分为外梗阻性无精子症（42例）和严重少精子症（精子密度＜5×106/ml，39例）。所有患者均排除常染色体核型异常，其中2例染色体核型为46，XY（大 Y），1例为 46，XY（小 Y）。所有患者均在上午8：00～10：00静脉采血进行血清性激素测定，包括卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和睾酮（testosterone，T）。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取：抽取受试对象静脉血2 ml，EDTA抗凝。所有样本的DNA用杭州博日科技有限公司的Biospin全血基因组DNA提取试剂盒提取。提取的DNA用紫外分光光度计测吸光度并计算DNA浓度。

1.2.2 引物：确定Y染色体AZF区域内的6个序列标签位点（sequence tag site，STS），分别是AZFa区的sY86（320bp） 和 sY84（326bp）、AZFb区域内的sY127（274bp）和 sY134（301bp）、AZFc区域内的sY254（400bp）和 sY255（126bp）。6对引物均由Invitrogen公司所合成。引物序列均已发表［2］。

1.2.3 质控：设立ZFY及SRY基因作为内对照，其引物序列已发表［2］。同时设立已生育的正常男性为阳性对照、正常女性作为阴性对照、水作为空白对照。每个标本检测需做2个多重PCR反应。为排除假阳性反应，对发现有微缺失的标本进行3次多重PCR检测，如果上述缺失仍无扩增信号，而SRY和ZFY均能正常扩增，则证实微缺失的存在；必要时，使用相应引物进行单重PCR扩增予以确认。

1.2.4 PCR检测：PCR反应总体系为 20μl，包括去离子水、缓冲液、dNTP、DNA聚合酶及模板。按下列条 件 扩 增 ：94℃ ，4min；95℃ ，1min；56℃ ，1min；72℃，1min；共 35个循环，72℃延伸 7min，最后置4℃保温。

1.2.5 电泳检测：取PCR扩增产物7μl，加10×loading buffer 1μl，在3.5%的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察分析。Y染色体微缺失者相应条带的PCR产物阙如。

1.2.6 DNA测序：所有PCR产物均经北京华大公司进行测序，证实了检测结果的特异性。

2 结果

2.1 多重PCR电泳所示Y染色体微缺失检测结果

81例患者中10例患者检测到微缺失，总发生率为12.35%。其中，42例非梗阻性无精子症中有6例存在微缺失，发生率为14.29%；39例严重少精子症患者中4例检测到微缺失，发生率为10.26%。10例微缺失患者中，1例为AZFa+AZFb+AZFc区（占总缺失率10.00%），2例为AZFb+AZFc区（占总缺失率 20.00%），1例为AZFb区（占总缺失率10.00%），6例为AZFc区（占总缺失率60.00%）。见图1。

如果多重PCR检测结果为阳性（即有缺失），我们通常使用相应引物进行单重PCR扩增予以确认，以排除假阳性反应。结果发现，目的条带为sY225的扩增产物（126bp）。见图2。

2.2 Y染色体微缺失患者AZF缺失类型及其表型

在临床表型的调查中，失访或拒绝提供染色体及睾丸大小等资料患者4人。其余6例微缺失患者中，4例睾丸体积小于正常值（12ml），1例患有隐睾及鞘膜积液，1例患有左精索静脉曲张和左侧睾丸鞘膜积液。6例AZF缺失患者的内分泌激素平均值分别为FSH19.42mIU/ml（参考值1.27～19.26mIU/ml），LH5.38mIU/ml（参考值 1.24～8.62mIU/ml），T3.74ng/ml（参考值1.75～7.81ng/ml）。81例患者中，2例染色体核型为46，XY（大Y），均未见缺失；1例染色体核型为46，XY（小Y）的患者AZFb+AZFc区缺失。具体临床表型见表1。

3 讨论

表1Y染色体微缺失患者AZF缺失类型及其临床表型Ta b.1Cl i n i c a l f e a t h u r e a n d AZFd e l e t i o n p h e n o t y p e s o f t h e p a t i e n t s w i t h Yc h r o mo s o me mi c r o d e l e t i o n No.Azoo/Oligo Testis volume Chromosome FSH LH T Deletion left/right（ml）karyotype（mIU/ml）（mIU/ml）（ng/ml）type 2 Azoo - 46，XY - - - AZFc 8 Oligo 6/6 46，XY 12.69 9.00 3.25 AZFc 27 Oligo Hydrocele testis 46，XY 33.76 7.02 4.59 AZFc 56 Oligo 7/6 46，XY 8.11 2.57 2.23 AZFc 60 Oligo - 46，XY - - - AZFc 65 Azoo 8/10 46，XY 11.73 3.46 3.75 AZFc 34 Azoo - 46，XY - - - AZFb 80 Azoo 6/6 46，XY（short Y） 33.04 6.44 3.78 AZFb+AZFc Normal size 82 Azoo left varicocele 46，XY 17.23 3.78 4.85 AZFb+AZFc Left hydrocele testis 55 Azoo - 46，XY - - - AZFa+AZFb+AZFc Oligo，severe oligospermia；Azoo，azoospermia.

1976 年，Tiepolo和Zuffardi发现在无精子症患者中存在显微镜下可见的Y染色体长臂的缺失，推测Y染色体长臂上可能存在着控制精子生成的基因，并称其为AZF。随着分子生物学及遗传学等学科的发展，人们对AZF结构、功能以及与男性不育之间关系的认识逐渐加深。1986年，Vergnaud初步建立了人类Y染色体缺失图谱；1996年，Voget等将AZF划分为3个无重叠区域，分别命名为AZFa、AZFb和AZFc；2002年，Repping又提出新的AZFb和AZFc分区与缺失模型［3］。

近十几年来，国内外很多实验室都相继开展了关于Y染色体微缺失的检测。Y染色体AZF总的缺失率在不同国家、不同种族之间存在明显差异，从1%～55%不等［4］。周友泉等总结中国无精症和少精症Y染色体微缺失的总缺失率为15.05%［5］。AZF不同区域的缺失率也不尽相同，其中AZFc区缺失率最高，AZFa区缺失率最低。在研究对象的选择上，大部分学者都集中在对原发性无精子症及少精子症进行研究，有的实验室则专门对准备接受胞浆内单精子注射技术 （intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗的不育患者进行检测。综合来看，AZF缺失率的差异主要与研究对象的选择、STS位点的选择与数量、实验设计的规范性等因素有关。近年来，Simoni等提出的多重PCR检测方案受到欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控协作网的推荐，得以广泛应用；该法被认为可检出95%以上的Y染色体微缺失［2］。本研究采用该方法，并对多重PCR产物进行了测序确认。在此基础上，我们检测了81例非梗阻性无精子症和严重少精子症患者，发现这组人群中AZF缺失总的发生率为12.35%。其中，非梗阻性无精子症患者中微缺失的发生率为14.29%；严重少精子症患者中微缺失的发生率为10.26%。就缺失类型而言，最多见的是AZFc区缺失，占60%；其次为AZFb+AZFc区缺失，占20%；其余类型为AZFa+AZFb+AZFc区和AZFb区，各占10%，检测结果与国内外大部分研究报道的相似。

Y染色体微缺失类型与临床表型的关系尚不完全清楚。目前认为，AZFa缺失导致唯支持细胞综合征；AZFb或AZFb+AZFc的缺失导致唯支持细胞综合征或生精阻滞。以上类型缺失临床上均表现为无精子，睾丸中也无精子存在，因此，不推荐患者进行睾丸取精或ICSI治疗。而AZFc缺失的患者临床表现多样，从无精子到严重少精子，甚至接近正常精子数；而且，无精子症患者的睾丸内仍有发现精子的可能，可通过ICSI助孕获得后代，但AZFc区缺失也将同时遗传给其男性后代［2］。本研究结果中，1例AZFa+AZFb+AZFc、2例AZFb+AZFc及 1例AZFb区缺失的患者均表现为无精子症，而AZFc区缺失的6例患者中2例表现为无精子症，4例表现为严重少精子症，支持上述研究结论。

染色体 46，XY（大 Y）及 46，XY（小 Y）曾被认为是染色体正常核型的变异。但近年来大Y及小Y染色体对生殖方面的影响已经越来越受到国内外的关注。Nagvenkar等研究了88位欲行ICSI治疗的不育患者，检测出染色体变异率为37.5%，其中小Y染色体是性染色体变异的最常见类型［1］。黄海燕等总结了117例大小Y染色体临床病例，认为Y染色体的变异均会不同程度地影响临床表现［6］。Blanco等认为Y染色体长臂DNA序列的重复复制会影响其有关精子分化和发育的基因正常表达，造成精子受精障碍或影响精子受精能力而导致流产频率增高［7］。大Y染色体可能是由于其异染色质区DNA过度重复而影响生殖细胞在减数分裂时染色体配对联会，使受精卵分化、分裂异常；而小Y染色体则可能是由于Y染色质部分或完全丢失或排列过度紧密而影响其基因的功能发挥［6］。本研究中，2例染色体核型 46，XY（大 Y）患者均未见缺失，而 1例 46，XY（小Y）患者为AZFb+AZFc区缺失，提示小Y导致精子生成障碍可能与Y染色体长臂远端的部分基因缺失有关。但本研究病例数较少，仍需进一步扩大样本量进行检测。

目前我国很多生殖中心都相继开展了Y染色体微缺失的检测项目。这项检测既为男性不育症提供了重要的病因学线索，又为非梗阻性无精子症患者睾丸穿刺或活检获取精子的结局提供一定的预测，从而使患者避免了不必要的手术创伤和经济负担。同时，由于开展了Y染色体微缺失检测项目，我们能够为一些患者提供个性化咨询与治疗。例如，有研究表明，AZFc缺失的患者可能出现精子数量随时间进行性减少的现象［8］；对这样的患者应该指导尽早接受治疗促其配偶怀孕，或采取冻存精子的方法以备将来的不育治疗。此外，AZF缺失检测还可以和种植前遗传学诊断等方法结合起来，避免AZF缺失患者将遗传缺陷传给其后代。

［1］Nagvenkar P，Desai K，Hinduja I，et al.Chromosomal studies in infertile men with oligozoospermia and non-obstructive azoospermia［J］.Indian JMed Res，2005，122（1）：34-42.

［2］Simoni M，Bakker E，Krausz C.EAA/EMQNbest practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions，State of the art 2004［J］.Int JAndrol，2004，27（4）：240-249.

［3］Repping S，Skaletsky H，Lange J，et al.Recombination between palindromesP5andP1onthehumanYchromosomecausesmassivedeletions and spermatogenic failure［J］.Am JHum Genet，2002，71（4）：906-922.

［4］Mittal RD，Singh G，Srivastava A，et al.Ychromosome micro-deletions in idiopathic infertility from Northern India ［J］.Ann Genet 2004，47（4）：331-337.

［5］周友泉，王厚照，刘芳，等.男性不育患者Y染色体AZF区域微缺失的 STS位点分析［J］.实用医技杂志，2006，13（14）：2432-2434.

［6］黄海燕，张香改，高羽，等.117例大小Y染色体临床意义分析［J］.中国计划生育学杂志，2007，136（2）：105-107.

［7］Blanco P，Shlumukova M，Sargent CA，et al.Divergent outcomes of intrachromosomal recombination on the human Ychromosome：male infertility and recurrent polymorphism ［J］.JMed Genet，2000，37（10）：752-758.

［8］Vogt PH.Genomic heterogeneity and instability of the AZFlocus on the human Ychromosome［J］.Mol Cell Endocrinol，2004，224（1-2）：1-9.

（编辑 陈 姜，英文编辑 郑华川）

Detection of YChromosomal Microdeletions in Patients with Spermatogenic Failure

KONGLin，PANBo-chen，DUQiang，YANGDa-lei
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the relationship between Ychromosomal microdeletions and chromosome karyotype，clinical phenotypes and sex hormone levels in patients with spermatogenic failure.MethodsSRYgene，ZFYgene and 6sequence-tagged-sites inAZFa，AZFbandAZFcwere detected with multiplex polymerase chain reaction in 42non-obstructive azoospermic and 39severe oligozoospermic men.ResultsTen cases（12.35%）of microdeletions were found in 81non-obstructive azoospermic（6cases）or severe oligozoospermic patients（4cases）.Among the 10patients with Ychromosomal microdeletions，1had deletion ofAZFa+AZFb+AZFc，2AZFb+AZFc，1AZFband 6AZFc.ConclusionMicrodeletions in the long arm of Ychromosome were associated with spermatogenic failure.Screening for Ychromosomal microdeletions in azoospermic or severe oligozoospermic patients should be of necessity and significance.

male infertility；azoospermia factor；Ychromosomal microdeletions；multiplex PCR；azoospermia；severe oligozoospermi

R711.6

A

0258-4646（2010）01-0037-03

孔琳（1982-），女，医师，硕士.

潘伯臣，E-mail：panpancmu@yahoo.com.cn

2009-07-01