伊立替康抑制人结直肠癌细胞增殖和ATP敏感性钾通道的相关性研究

张依宁，魏敏杰，孙明军

（中国医科大学 1.附属第一医院内镜科；2.药学院药理学教研室，沈阳 110001）

伊立替康抑制人结直肠癌细胞增殖和ATP敏感性钾通道的相关性研究

张依宁1，魏敏杰2，孙明军1

（中国医科大学 1.附属第一医院内镜科；2.药学院药理学教研室，沈阳 110001）

目的 检测肿瘤化疗药物伊立替康（CPT-11）对人结直肠癌HCT-116细胞和HT-29细胞的作用，并探讨可能机制。方法 用MTT比色法检测细胞增殖；用Transwell法检测细胞侵袭力；用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；用流式细胞术PI单染法检测细胞周期；用膜片钳方法检测ATP敏感性钾电流（IKATP），并比较药物对两种细胞作用的异同。结果 1.0～64.0μg/ml的CPT-11呈剂量依赖性和时间依赖性抑制HCT-116和HT-29的增殖，CPT-11抑制HCT-116和HT-29细胞增殖作用的半数抑制浓度（IC50）分别为39.3和19.5μg/ml；近似IC50浓度的CPT-11作用48h可使HCT-116和HT-29细胞阻滞于G0/G1期及S期，其中G0/G1期及S期比例分别从27.4%和17.4%上升至95.9%和98.2%，该浓度的CPT-11作用48h还可诱导HCT-116和HT-29细胞凋亡，凋亡率分别从14.8%和9.3%上升到36.9%和27.9%。CPT-11对HCT-116和HT-29细胞的侵袭抑制率分别为40.8%和47.5%。CPT-11可剂量依赖性的降低HCT-116和HT-29细胞膜IKATP水平。结论 CPT-11能有效抑制人结直肠癌HCT-116和HT-29细胞增殖和侵袭力、诱导细胞凋亡，且对HT-29细胞的作用较强；CPT-11抑制细胞增殖作用与其抑制细胞膜ATP敏感性钾通道开放相关。

伊立替康；HCT-116细胞；HT-29细胞；细胞增殖

伊立替康（irinotecan，CPT-11）是喜树碱的半合成物，是特异性的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂［1］，应用于多种肿瘤治疗，也是较早应用于转移性结直肠癌的药物。由于其抗肿瘤作用与ATP敏感性钾通道的相关性研究尚未见报道，故本实验在研究CPT-11对人结直肠癌HCT-116和HT-29细胞增殖作用的同时，检测了对细胞膜ATP敏感性钾电流（IKATP）的影响，旨在探讨CPT-11抗大肠癌细胞增殖作用与ATP敏感性钾通道及IKATP的相关性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

CPT-11，购自江苏恒瑞制药公司，用0.9%无菌生理盐水配成所需浓度；格列本脲、四氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、RNase A均购自 Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；RPMI1640培养基，购自美国Gibco BRL公司；Annexin v-FITC/PI双染凋亡试剂盒，购自晶美生物工程有限公司；Transwell，购自美国Corning公司；流式细胞仪，美国BDFASCSCalibur公司产品；垂直电极拉制器（Narishige PC-10，日本）；膜片钳（Axon Instrument 700B）。

1.2 结直肠癌细胞株

人结直肠癌细胞株HCT-116和HT-29，由中科院上海细胞生物学研究所细胞库提供。用含10%标准FBS的RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养传代。

1.3 溶液

电极外液：NaCl 143mmol/L，KCl 5.4mmol/L，CaCl21.8mmol/L，MgCl20.5mmol/L，NaH2PO40.3mmol/L，HEPES5mmol/L，NaOH2.3mmol/L，葡萄糖5mmol/L，用1mmol/LNaOH将pH值调至7.4。电极内液：NaCl 143mmol/L，KCl 5.4mmol/L，MgCl20.5mmol/L，Na2ATP0.3mmol/L，EGTA5.0mmol/L，用 1mmol/LNaOH将pH值调至7.4。

1.4 MTT法检测药物抑制HCT-116和HT-29细胞增殖的作用

1.4.1 给药浓度：参照文献［2］的方法设立CPT-11不同浓度处理组，CPT-11作用HCT-116和HT-29细胞的终浓度分别为 1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0和64.0μg/ml；设立阴性对照组（无菌生理盐水）。

1.4.2 MTT检测：将对数生长期的细胞分别进行处理并继续培养24h和48h后，向各孔加入5mg/ml的 MTT20μl，37℃继续培养 4h，弃板内液体，然后每孔加入150μl DMSO，60r/min振荡10min，用酶标仪 570nm 检测光密度（optical density，OD）值，实验重复3次，计算生长抑制率（%）=（对照孔OD均值-实验孔OD均值）/对照孔OD均值×100。

1.5 流式细胞术PI单染法检测细胞周期

将处于对数生长期的细胞进行药物处理，根据两株细胞对药物的反应，确定两株细胞单一剂量用药的浓度 HCT-116为 32.0μg/ml，HT-29为 16.0μg/ml，作用48h后收集细胞，轻轻吹打成单细胞悬液，1000r/min，4℃，离心 10min，弃上清，加入 1ml冰冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，重复以上步骤2次，用100g/ml浓度的RNase-A和100g/ml浓度的PI溶液各500μl重悬细胞，37℃避光孵育30min后进行流式细胞仪检测。

1.6 Transwell法检测药物对HCT-116和HT-29细胞侵袭力的影响

将无血清的RPMI1640与Matrigel基质胶按照8∶1混合，向 Transwell板的每个小室铺 100μl该混合液，置于37℃、5%CO2培养箱孵育4h。将100μl浓度为2.5×105/ml的细胞悬液加入Transwell板的上室，并同时给药处理，下室中加入500μl含有20%血清的培养基。置于37℃、5%CO2培养箱孵育指定时间，取出Transwell用PBS清洗，擦去基质胶和上室细胞，PBS清洗3次，甲醇固定20min，0.1%结晶紫染色20min，PBS清洗3次，自然风干后在显微镜下观察照相。计数侵入滤膜的细胞数，共计数中央和四周各5个视野（×200），取平均值。实验重复3次，药物对细胞侵袭力的抑制率（%）＝（用药前侵入滤膜细胞数均值－用药后侵入滤膜细胞数均值）/用药前侵入滤膜细胞数均值×100。

1.7 流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测药物对HT-29细胞凋亡的影响

将处于对数生长期的细胞调整至1×106/ml，贴壁后进行药物处理。作用指定时间后收集细胞，用胰酶将细胞消化，取1ml细胞，1000r/min，4℃，离心10min，弃上清，加入1ml冰冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，重复以上步骤2次，将细胞重悬于200μl结合缓冲液中，加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI，轻轻混匀，37℃避光反应15min。最后加入300μl结合缓冲液，轻轻混匀，1h之内用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

1.8 膜片钳技术记录全细胞模式下IKATP的变化

将玻璃电极轻压在细胞表面，进行千兆封接，当形成全细胞状态后用Pclamp 10.0程序记录细胞膜离子电流的变化。IKATP的电压钳制方案：设保持电位-40mV，刺激电位为-100mV～+50mV，步阶脉冲10mV，波宽300ms，刺激间隔6s。应用K+ATP通道特异性拮抗剂格列本脲证实所引电流为IKATP，应用不同浓度CPT-11处理细胞，监测IKATP的变化。

1.9 统计学处理

使用Pclamp10.0程序中的Clampfit软件进行膜片钳电流大小的测量和分析，结果用±s表示。数据处理使用SPSS13.0软件包完成；组间比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CPT-11抑制HCT-116和HT-29细胞增殖

1.0～64.0μg/ml的 CPT-11作用 HCT-116细胞和HT-29细胞48h时，均呈剂量依赖性抑制细胞增殖作用，半数抑制浓度（50%inhibiting concentration，IC50） 分别为 39.3和 19.5μg/ml，CPT-11抑制 HT-29细胞增殖作用强于抑制HCT-116细胞增殖作用（P<0.05）。见图 1。

2.2 CPT-11对HCT-116和HT-29细胞周期的影响应用 32.0μg/ml和 16.0μg/ml的 CPT-11分别

处理HCT-116和HT-29细胞48h，均可抑制细胞由G0/G1期及S期向G2/M期的过渡（P<0.05），从而将肿瘤细胞阻滞于G0/G1期及S期，抑制细胞的增殖。对两株细胞进行比较发现，HT-29比HCT-116对药物的反应更加敏感，较低药物浓度即对HT-29细胞有较强的抑制作用。见表1。

表1CPT-11对HCT-116、HT-29细胞周期的作用（x±s，%）Ta b.1Th e e f f e c t o f CPT-11o n t h e c e l l c y c l e（x±s，%）Cell cycle HCT-116 HT-29Control CPT-11group Control CPT-11group G0/G1 8.10±2.43 52.18±5.641） 5.88±3.15 96.31±4.131）S19.30±5.12 43.76±5.871） 11.51±7.01 1.86±6.701）G2/M 72.60±6.76 5.06±1.121） 82.61±5.36 1.83±2.401）1）P<0.05，compared with control.

2.3 CPT-11对HCT-116和HT-29细胞侵袭力的影响

应用 32μg/ml和 16μg/ml的 CPT-11分别处理HCT-116与HT-29细胞24h和48h，细胞侵袭力均被抑制，且存在时间依赖性。见表2。

表2CPT-11对HCT-116、HT-29细胞侵袭力的抑制作用（±s）Ta b.2Th e i n h i b i t i n g e f f e c t o f CPT-11o n c e l l i n v a s i v e n e s s（±s）HCT-116 HT-29Invasive cell Inhibiting rate（%） Invasive cell Inhibiting rate（%）0h 443.4±78.9 0 551.1±105.3 024h 115.7±21.5 26.1±5.11） 156.5±33.3 28.4±6.21）48h 267.4±35.7 40.8±6.51），2） 289.3±45.8 47.5±7.81），2）Time point 1）P<0.05，compared with 0h；2）P<0.05，compared with 24h.

2.4 CPT-11对HCT-116和HT-29细胞凋亡的影响

应用 32μg/ml和 16μg/ml的 CPT-11分别处理人结直肠癌HCT-116和HT-29细胞24h和48h后，均能促进两株细胞的凋亡，其中以晚期凋亡作用（UR）明显（P<0.05），并具有时间依赖性。见表3。

表3CPT-11对HCT-116、HT-29细胞凋亡的诱导作用（±s）Ta b.3CPT-11i n d u c e d t h e a p o p t o s i s o f HCT-116a n d HT-29（±s）Time point HCT-116 HT-29UR（%） LR（%） UR（%） LR（%）0h 4.24±1.37 10.57±2.10 7.19±1.15 2.12±0.2924h 11.21±1.121） 12.25±2.12 12.51±2.151） 4.27±1.1248h 19.09±3.071），2） 17.90±4.531） 21.54±5.571），2） 6.38±1.921）UR，up right quadrant，necrosis+delayed apoptosis；LR，low right quadrant，apoptosis.1）P<0.05，compared with 0h；2）P<0.05，compared with 24h.

2.5 CPT-11对HCT-116和HT-29细胞膜IKATP的影响

刺激电位为-100mV～+50mV时，可以记录到外向电流，该电流可被IKATP特异性拮抗剂50μmol/L格列本脲所抑制，说明所引出电流为细胞膜的IKATP。用 4.0，16.0和 64.0μg/ml的 CPT-11处理细胞，在同一指令电压下记录细胞膜IKATP变化，结果显示随着CPT-11浓度增加，IKATP可见剂量依赖性的减小，CPT-11作用引起的细胞膜上的IKATP变化与CPT-11的药物浓度呈剂量依赖性负相关。见图2。

3 讨论

CPT-11在组织中羧酸脂酶的作用下生成活性代谢产物，SN-38是其最具活性的代谢产物之一，通过抑制拓扑异构酶Ⅰ而特异性抑制DNA链重组，引起DNA长链断裂，从而使DNA的复制受阻、失衡，导致肿瘤细胞死亡［3，4］。本研究结果表明，应用CPT-11处理48h后，HCT-116的细胞周期均发生改变，G2/M期细胞明显减少，而G0/G1期及S期细胞增加，说明CPT-11能周期特异性地抑制人结直肠癌细胞HCT-116的增殖。

细胞膜ATP敏感性钾通道在肿瘤细胞生长中的作用是近来肿瘤研究的热点之一［5～7］，但是关于在结直肠癌中CPT-11抗肿瘤作用与K+通道的相关性研究尚未见报道。肿瘤细胞的生物电特性不同于正常细胞，其细胞膜电位有去极化趋势，而细胞膜去极化被认为是肿瘤细胞增殖的关键，而这与K+通道及K+电流密切相关。据报道，在前列腺癌及成神经细胞瘤中，K+电流对细胞的增殖起着重要的调控作用［8］。细胞膜上的K+通道促进肿瘤细胞增殖，并且抑制K+通道功能或下调K+通道表达可抑制肿瘤发生，表明K+通道在肿瘤细胞的增殖、浸润和转移等过程中的重要作用［9，10］。

本实验应用CPT-11作用人结直肠癌细胞HCT-116及HT-29，证实了CPT-11能够抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭，并能诱导细胞凋亡。并进一步应用膜片钳检测CPT-11对HT-29与HCT-116细胞膜电流的影响，发现CPT-11对两种细胞均具有较好的剂量依赖性负相关作用，通过应用ATP敏感性钾通道特异性拮抗剂格列本脲证明为ATP敏感性钾通道。说明CPT-11对HCT-116及HT-29细胞的抑制作用可能与细胞膜上的ATP敏感性钾通道的相关。但是否还有其他机制参与，或是否有其他亚型的钾通道参与以及可能的调控机制，则有待于进一步研究。

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（编辑 陈 姜，英文编辑 郑华川）

The Correlation between the Inhibiting Effects of Irinotecan on Colorectal Cancer Cell Proliferation and ATP-sensitive Potassium Channel

ZHANGYi-ning1，WEIMin-jie2，SUNMing-jun1

（1.Department of Endoscopy，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Pharmacology，College of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effects of Irinotecan （CPT-11）on human colorectal cancer HCT-116and HT-29cells and investigate the potential mechanisms.MethodsThe effect of Irinotecan on the proliferation of HCT-116and HT-29cells was determined by MTTassays.The invasive capacity was measured by transwell assays，and the apoptosis of the tumor cells was detected by flow cytometry after stained with Annexin-Vand PI.The difference between the current of ATP-sensitive potassium ion of HCT-116and HT-29was examined by patch clamp.ResultsIt was found that 1.0-64.0μg/ml CPT-11could inhibit the proliferation and the invasive capacity of HCT-116and HT-29cells at both dose-and time-dependent manner.The IC50of HCT-116and HT-29were 39.3and 19.5μg/ml respectively.Cytometry showed that the apoptotic rates were increased from 14.8%and 9.3%to 36.9%and 27.9%after the treatment of 32.0μg/ml and 16.0μg/ml CPT-11，which were close to their IC50.The proportion of G0/G1and Sof HCT-116and HT-29was enhanced from 27.4%and 17.4%to 95.9%and 98.2%.Transwell assay indicated that the invasiveness of HCT-116and HT-29was reduced by 40.8%and 47.5%.The patch clamp showed that CPT-11reduced the IKATPof cell membrane at a negative dose-dependent manner.ConclusionCPT-11could have a significant impact on the proliferation，invasiveness，cell cycle，and the apoptosis of human colorectal cancer cell HCT-116and HT-29.HT-29was more sensitive to CPT-11than HCT-116.The inhibitory effect of CPT-11on cell proliferation might be linked to its inhibition of ATP-sensitive potassium channel.

irinotecan；HCT-116cell；HT-29cell；cell proliferation

R735.3

A

0258-4646（2010）01-0010-04

辽宁省教育厅高校科研基金资助项目（2004D172）；辽宁省科技攻关项目（2007225017，2009225011-2）

张依宁（1982-），男，硕士研究生.

孙明军，E-mail：smjmw@sina.com

2009-07-15