蛇床子素在兔体内的药动学研究

郑立卿， 张丹参，2*， 张 力， 薛贵平， 武海霞

(1.河北北方学院药理教研室，河北张家口075000;2.河北医科大学，河北石家庄051500)

蛇床子素(Osthol，Ost)，是从伞形科植物蛇床干燥成熟果实蛇床子中提取的单体成分，是一种烃基香豆素衍生物［1］。药理作用广泛，可抑菌［2］，调节肝脏代谢酶的功能［3］，抑制肿瘤细胞增殖［4］，保肝护肺［5-6］等。在国内虽应用广泛，研究报道多集中于化学成分、含量测定、制备工艺、药理作用、临床应用和体内测定方法。但临床药理学研究资料报道较少，本实验采用RP-HPLC法研究了兔血浆中Osthol，首次以3个剂量组对其进行药动学研究，考察此常规剂量范围内是否符合线性动力学特征，为其安全、合理用药提供依据。首次研究了ip、iv、ig 3种给药途径的药代动力学特点，阐明蛇床子素在动物体内的药代动力学规律，为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

动物 新西兰白兔，体重(2.0±0.3)kg，中国协和医科大学实验动物中心提供，给药前禁食12 h，自由饮水。

仪器与条件 D-37520超速低温离心机(德国Heraeus公司)。

惠普1100系列高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，紫外监测器，色谱柱:YWG-C18(4.6 mm×250 mm，10 μm)(大连依利特公司)，流动相∶甲醇-水(80∶20)，流速:1 mL/min，检测波长:322 nm，柱温:27℃，用微量进样器手动进样，进样量为20 μL，内标:丹皮酚。

药品和试剂 蛇床子素标准品，纯度98.8%(批号110822-200608)，丹皮酚(paeonol)标准品(批号110708-200505)均由中国药品生物制品检定所提供;甲醇和乙腈均为色谱纯，其他化学用品为化学纯，实验用水全部为三重蒸馏水。

血浆处理 精密量取血浆100 μL加入乙腈200 μL(含内标)，充分震荡摇匀后12 000 g冷冻(-5℃)离心6 min，分离沉淀蛋白，吸取上清液过0.45 μm有机微孔滤膜，置-20℃冰箱保存，备测。

2 结果

2.1 色谱行为 从色谱图上可以看出，蛇床子素的保留时间为6.8 min，内标丹皮酚的保留时间为4.5 min，专一性好，峰型良好且与杂质峰分离较好，血浆色谱图见图1。

图1 空白血浆(A)、含内标血浆(B)、血浆样品(C)HPLC色谱图Fig.1 Chromatograms of blank plasma plasma(A)，plasma with interior(B)，and plasma samble(C)

2.2 生物样品中蛇床子素测定方法的确认

2.2.1 血浆标准曲线的制备 等比稀释法配制0.125、0.25、0.5、1、2 和 4 μg/mL 的系列血浆标准溶液样品。处理后，HPLC测定。蛇床子素与内标的峰面积之比(A)对浓度(C)进行回归计算得到的回归方程为:A=0.360 2 ×C+0.050，r=0.999 3，线形范围为0.125～4.000 μg/mL。最低检测浓度为6.25 ×10-3μg/mL。

2.2.2 回收率和精密度实验 平行配制0.5、1.0和4.0 μg/mL三个浓度的蛇床子素血浆标准溶液各3份，按“血浆处理”项下操作处理，HPLC测定，所测得的峰面积与相同浓度溶剂配置的溶液的峰面积的比值即为绝对回收率，分别为89.02%、90.40%和91.3%;峰面积代入回归方程求得的浓度与实际浓度比值为相对回收率，分别为102.5%、101.2%、98.8%(n=4)，日内精密度(RSD，n=3)分别为2.5%、3.6%、3.2%。按上法平行操作连续测定3 d，得到日间 RSD(n=9)分别是 4.5%、5.8%、5.4%。

2.3 药代动力学研究

2.3.1 腹腔给药 18只白兔，随机分成3组。氨基甲酸乙酯(iv，1 mg/kg)麻醉后，分离颈总动脉，连接在“三通”管两端，iv1%肝素钠1 mL/kg肝素化动物。循环约10 min。清醒后三组分别ip蛇床子素15、30 和60 mg/kg 三个剂量，于给药后的 5、10、20、30、45、60、75、90、110、125 min，取血约 1 mL，制备血浆样品并测定药物含量，绘制时量曲线，将数据用3P87程序拟合。结果见图2，表1。

图2 三个剂量15、30、60 mg/kg-ip给药后的血药浓度-时间曲线(每个点代表6个血药浓度的±s)Fig.2 Plasma concentration-time curves of osthol after a single ip dose of 15，30，60 mg/kg to rabbits.(Each point represents the mean data from 6 rabbits，±s)

表1 药代动力学参数(±s，n=6)Table 1 Pharmacokinetics parameters(±s，n=6)

表1 药代动力学参数(±s，n=6)Table 1 Pharmacokinetics parameters(±s，n=6)

*P＜0.05 15 vs 30 mg/kg;▲P＜0.05 30 vs 60 mg/kg

参数 单位剂量/(mg/kg)5.697±1.2 2.736±1.3 0.807±7.2 Ke min-1 0.013±0.003 0.012±0.002 0.014±7.2 Ka min-1 0.210±0.1 0.172±0.2 0.180±0.1 t1/2(Ka) min 8.12±2.3 10.43±3.2 7.57±2.1 t1/2(Ke) min 82.66±5.2▲ 52.41±7.2*▲ 52.42 ±5.7*T(peak) min 23.35±7.4 29.50±7.6 28.94±6.9 C(max) μg·mL-1 3.57±1.6▲ 1.60±0.7*▲ 0.87±0.6*CL kg-1·min-1 0.22±0.1 0.29±0.1 0.11±0.1 AUC μg·min·mL-1 306.64±27.2▲ 147.98±17.7*▲ 62.73±7.2*60 30 15 A μg·mL-1 MRT min 50.87±7.8 60.63±6.2 60.05±8.2

从图中可以看出:3个给药剂量均可在5～20 min左右的时间里达到最高血药浓度，然后开始下降。60 mg/kg剂量给药时，在10 min左右即可达到3.5 μg/mL的血药高峰，然后很快下降，但在120 min时，血药浓度仍可达1.5 μg/mL;30 mg/kg剂量给药时在5 min可以达到1.6 μg/mL的高峰，然后就开始下降，到120 min时血药浓度可降为0.5 μg/mL;15 mg/kg剂量给药时，在20 min左右也可逐渐出现血药浓度的高峰0.9 μg/mL，但下降非常缓慢，在给药后120 min时血药浓度仍可维持在0.5 μg/mL。

用3P87药代动力学软件对蛇床子素在兔体内的血药浓度曲线分别按一室、二室、三室进行Marquard拟合，对3种模型利用F检验进行方差分析。结果表明，ip3种剂量蛇床子素在家兔体内的动力学行为符合符合一级消除一室模型，药物代谢动力学参数见表1，其中3种剂量 AUC分别为306.64、147.98、62.73(μg·min)/mL，与剂量呈正比(r=0.999 8)，说明在此剂量范围内本品在兔体内的消除为线性动力学。

2.3.2 静脉给药 白兔6只，iv蛇床子素15 mg/kg，于不同时间由颈动脉取血，测定血浆药物浓度，绘制药时曲线，计算药代动力学参数(表2，图3)。结果表明，iv蛇床子素，属一级吸收，一级消除二室模型。

表2 蛇床子素15 mg/kg药代动力学参数(±s，n=6)Table 2 Pharmacokinetics parameters(±s，n=6)

表2 蛇床子素15 mg/kg药代动力学参数(±s，n=6)Table 2 Pharmacokinetics parameters(±s，n=6)

参数 单位 蛇床子素溶液 参数 单位 蛇床子素溶液A μg·mL-1 15.5 ±7.2 T1/2βmin 20.4±2.29 B μg·mL-1 2.1±1.0 K21 min-1 0.038±0.009 min-1 0.167±0.015 K12 min-1 0.048±0.006 β min-1 0.013±0.004 K10 min-1 0.056±0.008 Vc L·kg-1 0.81±0.24 AUC μg·min·mL-1 335.2±84.6 T1/2α min 6.5 ±2.2 CL(s) L·kg-1·min-1 α 0.057±0.005

图3 15 mg/kg iv给药后的血药浓度-时间曲线(每个点代表6个血药浓度的±s)Fig.3 Plasma concentration-time curves of osthol after a single dose of 15 mg/kg to rabbits.(Each point represents the mean data from 6 rabbits，±s)

2.3.3 灌胃给药 白兔6只，ig蛇床子素60 mg/kg，于给药后不同时间取血，测定血浆药物浓度，结果仅在ig后30、60 min测得原型药，浓度很低，其他各时间点均未检出。

2.3.4 血浆蛋白结合率 采用平衡透析法。透析袋6 mm×10 cm，袋外液为30 mL磷酸盐缓冲液(0.02 mol/L，pH=7.4)，内含0.15 mol/L 氯化钠，蛇床子素的浓度为分别为2、10、20 μg/mL(n=16)于恒温振荡器内25℃恒温下缓慢振荡，透析72 h后，按下式计算蛇床子素与兔血浆蛋白结合率。

药物血浆蛋白结合率=(袋内浓度-袋外浓度)/袋内浓度×100%。结果发现，蛇床子素的兔血浆蛋白结合率分别为81.53% ±4.31%，70.50%±4.68%，77.21% ±1.37%。血浆蛋白结合率为76%。

3 讨论

蛇床子素ip吸收快，消除快，3个剂量t1/2依次为82.7、52.4、52.4 min，AUC 依次为 306.64、147.98、62.73;iv蛇床子素15 mg/kg相对消除快(t1/2=20.4)，生物利用度高 AUC=335.2;与 iv相比，ip蛇床子素15 mg/kg后的消除半衰期明显延长(P＜0.001)，但很不完全，生物利用度很低(18.8%)。药代动力学处理结果表明，兔ip蛇床子素后的药代动力学过程符合一室模型，iv药代动力学过程符合二室模型，与文献报道相似［8］。

不同给药途径半衰期的差异，我们推测可能与两种给药途径的不同组织分布有关。已有数据证明ip蛇床子素后的组织分布情况都表现出分布在生殖系统和血窦丰富的药物浓度远远高于血浆，脑组织药物浓度最低［9］且血浆蛋白结合率较高。因此推测，ip后兔的脂肪组织可能成为蛇床子素的一个“储库”，药物从脂肪组织中缓慢释放入血，导致ip的血浆消除半衰期较长。

蛇床子素ip 15、30、60 mg/kg剂量达峰时间没有大的差别(P＞0.05)，加大剂量时峰值并未滞后，提示多个转运机制的存在，在高剂量时体内摄取药物的机制有待进一步研究。

［1］You L，Feng S，An R，et al.Osthole:a promising lead compound for drug discovery from a traditional Chinese medicine(TCM)［J］.Nat Prod Commun.2009 Feb;4(2):297-302.

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［3］Zhang Y，Xie ML，Xue J，et al.Osthole regulates enzyme protein expression of CYP7A1 and DGAT2 via activation of PPARalpha/gamma in fat milk-induced fatty liver rats［J］.J Asian Nat Prod Res，2008，10(7-8):807-812.

［4］龚海英，张 丽，李建宇，等.蛇床子素对乳腺癌MCF27细胞增殖的影响［J］.武警医学院学报，2008，17(4):281.

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