绵羊β3肾上腺素能受体基因多态性分析

武建亮，许登高，乔利英，刘文忠

（山西农业大学动物科技学院，太谷 030801）

β3肾上腺素能受体 （beta－3 adrenergic receptor，ADRB3）是一种G蛋白耦联的膜表面受体，属于G蛋白耦联受体超家族的成员之一。具有调节脂肪分解和能量消耗的作用，其生理功能主要是作用于脂肪组织，通过交感神经系统来刺激褐色脂肪组织和白色脂肪组织中的脂肪分解产生热量［1］。在人类中ADRB3编码的蛋白质序列在64位点存在Trp64Arg突变，而Trp64Arg突变可减弱脂肪分解的活性［2］，Trp64Arg多态性还与肥胖、2－型糖尿病、高血压等症状有密切关系［3－4］。在绵羊ADRB3基因中，共检出 13 种不同的基因型［5－6］，ADRB3 多态性与羔羊的存活率、初生重和胴体组成都存在关联效应［7－9］。对ADRB3基因多态性的研究为绵羊分子育种体系的建立提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究以12个绵羊品种（系）为研究对象，共采集962只个体的血液样品。其中广灵大尾羊（Guangling Fat－tailed sheep，GLT，n＝35）、大尾寒羊（Fattailed Han sheep，LTH，n＝22）、小尾寒羊（Small－tailed Han sheep，STH，n＝146）、晋中绵羊（Jinzhong sheep，JZH，n＝40）、山西肉用绵羊（Shanxi Dam Line，SDL，n＝270）、山西细毛羊（Shanxi Fine－wooled sheep，SFW，n＝40）、杜泊羊（Dorpor，DRP，n=45）、考力代羊（Corriedale，CRD，n=53）、特克塞尔羊 （Texel，TXL，n=38）、南非肉用美利奴羊（South Africa Mutton Merino，SMM，n=198）、陶赛特羊（Polled Dorset，DST，n=36）、德国肉用美利奴羊（German Mutton Merino，GMM，n=39）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用酚-氯仿抽提法提取绵羊全基因组DNA。

1.2.2 PCR-SSCP分析 根据GenBank公布的绵羊ADRB3基因序列（登录号：DQ269497），通过软件Primer 5.0自行设计1对引物。引物序列为：Forward 5’-CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC-3’和 Reverse 5’-CCCAACTCCCAACCCGATC-3’，由上海英骏生物有限公司合成。扩增产物为绵羊ADRB3基因部分内含子序列，扩增片段长度为265 bp。PCR扩增采用15 μL体系，PCR扩增程序为：94℃预变性4 min，35个循环（94℃变性30 s，63℃退火 30 s，72℃延伸 30 s），72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，取2 μL PCR扩增产物加入8 μL变性缓冲液，经98℃热变性10 min，立即置于冰上冰浴10 min，取10 μL经过8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。电泳条件：4℃、120 V、5 W电泳12 h。采用硝酸银染色法染色，凝胶成像系统成像后判断带型。

1.2.3 克隆测序 通过PCR-SSCP检测后挑选不同基因型的个体进行克隆测序。将PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯割胶，用试剂盒纯化回收后，用pMG-T载体连接试剂盒（北京天根）连接转化，筛选阳性克隆经质粒提取检测后送北京诺塞基因有限公司测序。

1.3 数据分析 用 Goudel（2001） 的 FSTAT（Version 2.9.3）软件计算每个品种（系）该基因位点的等位基因频率、等位基因丰度（rs）和基因多样性（Hs）。基因多样性的计算公式如下：

式中，nk为第i个种群的个体数，Pik为第k个种群中Ai的等位基因频率，Hok为第k个种群的观察杂合度。用Popgene 3.2软件计算有效等位基因数（Ne）。用MEGA 4.0软件进行序列比对。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果 图1为PCR扩增产物检测结果。由图1可见，引物PCR扩增产物大小与预期结果一致，扩增条带整齐、特异性强、产量高，结果理想，可用于后续研究。

图1 PCR扩增产物检测结果

2.2 PCR-SSCP分析 对ADRB3基因5’端设计的引物扩增片段长265 bp，适合做SSCP分析。通过对12个品种（系）962个个体的PCR-SSCP检测，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现，所研究绵羊的ADRB3基因在该扩增片段上存在多态性，共检测出 A、B、C、D、E、F、G 和 H 八种不同带型，分别代表8种不同的基因型。

图2 绵羊ADRB3基因的PCR-SSCP结果

2.3 绵羊ADRB3基因遗传多态性分析

2.3.1 等位基因频率 在所检测的ADRB3基因位点中有多态性，共检测到8种等位基因。该基因片段的不同基因型在12个绵羊品种（系）中的频率列于表1。在不同的绵羊品种（系）中所检出的基因型也有所不同，基因型B和C在12个品种（系）中频率较高，为优势基因型，基因型H只在南非肉用美利奴绵羊中检出，为该绵羊品种特有的基因型。

表1 各基因型在不同绵羊品种中的频率

2.3.2 有效等位基因数和等位基因丰度 就本研究中绵羊ADRB3基因位点而言，总群体有效等位基因数为2.240，等位基因丰度即独立于样本大小的等位基因数为6.515（表2）。有效等位基因数最多的为小尾寒羊，等位基因丰度最高的为广灵大尾羊，有效等位基因数和等位基因丰度最小的种群均是山西细毛羊。

2.3.3 基因多样性 12个绵羊品种（系）中，ADRB3基因位点的基因多样性范围为0.050～0.729（表2），山西细毛羊的最小，小尾寒羊的最大，除山西细毛绵羊外，ADRB3基因在不同绵羊品种（系）中均表现出高度或中度多态性，具有较高的遗传多样性。

2.4 绵羊ADRB3基因部分序列核苷酸变异 序列测定及比对结果表明，8种不同基因型中共包含10个SNPs，其中基因型A包含一个A碱基的插入。绵羊ADRB3基因部分序列核苷酸变异与基因型情况见表3。

表2 不同绵羊品种（系）中有效等位基因数、等位基因丰度和基因多样性无偏估计值

表3 绵羊ADRB3基因部分序列核苷酸变异与基因型

3 讨论

3.1 绵羊ADRB3基因多样性 本研究通过PCR－SSCP对绵羊ADRB3基因多态性分析，共检出8种不同的基因型，这与Byun等［5］对新西兰绵羊检测出8种基因型和Yang等［6］对中国藏系绵羊检测出13种基因型的结果是相似的，都表明绵羊ADRB3基因存在较高的遗传多样性。而造成差异的原因可能是所研究的绵羊品种（系）不同而导致的，也可能是所选取的该基因序列片段不同而引起的。Forrest等［7－9］的研究表明，ADRB3 基因的不同基因型与羔羊的初生重、日增重、胴体组成以及羔羊的抗寒性存在着关联效应。因此基于ADRB3多态性与绵羊不同的生长、生产性能之间的关联性应该进行更进一步的研究。

3.2 绵羊遗传资源的保护 从前人的研究和本实验的研究来看，山西地方绵羊品种相对来说具有丰富的遗传资源，是人类宝贵的基因库，应该加以保护和利用［10－11］。本研究对ADRB3基因的遗传多样性检测，为我国绵羊的地方品种遗传资源提供了一些依据。就山西地方绵羊品种而言，晋中绵羊和广灵大尾羊的基因多样性值均大于0.5，表明其遗传多样性较为丰富，而山西细毛羊的基因多样性值仅为0.05，说明其遗传多样性贫乏，应该给予重视，加以保种。尤其是随着畜禽品种杂交改良的开展，大量国外优良高产品种的引入以及近年来农业产业结构的调整等因素的影响，晋中绵羊和广灵大尾羊也不可避免地受到冲击，如果不及时对晋中绵羊和广灵大尾羊进行品种特性研究和保护，晋中绵羊和广灵大尾羊将重蹈我国其它濒危或已灭绝的地方家畜品种的覆辙。从生物遗传多样性和畜牧业可持续发展的角度来看，对该品种的保护已刻不容缓。

［1］Cannon B，Nedergaard J.Brown adipose tissue：function and physiological significance［J］.Physiol Rev，2004，84：277－359.

［2］Usunekazu T，Yoshihide T，Saoki N，et al.Trp64Arg mutation of β3－adrenoceptor gene deteriorates lipolysis induced by β3－adrenoceptor agonist in human omental adipocytes［J］.Diabetes，1999，48：117－120.

［3］Shihara N，Yasuda K，Moritani T，et al.The association between Trp64Arg polymorphsim of the β3－adrenergic receptor and autonomic nervous system activity［J］.JClin EndocrinolMetab，1999，84：1623－1627.

［4］Ringel J，Kreutz R，Distler A，et al.The Trp64Arg polymorphsim of the β3－adrenergic receptor gene is associated with hy －pertension in men with type 2 diabetes mellitus［J］.Am J Hypertension，2000，13：1027－1031.

［5］Byun S O，Fang Q，Zhou H，et al.Rapid genotyping of the ovine ADRB3 gene by polymerase chain reaction－single－strand conformation polymorphism（PCR －SSCP）［J］.Mol Cell Probes，2008，22：69－70.

［6］Yang G，Zhou HT，Hu J，et al.Extensive diversity of the ADRB3 gene in Chinese sheep identified by PCR－SSCP［J］.Bichem Genet，2009，47：498－502.

［7］Forrest R，Hickford JGH，Hogan A，et al.Polymorphism at the β3－adrenergic receptor loucus：associ ations with birth weight，growth rate，carcass compositionn and cold sruvival［J］.Animal Genet，2003，34：19－25.

［8］Forrest R，Hickford J G H，Wynyard J，et al.Polymorphism at the β3－adrenergic receptor（ADRB3） loucus of Merino sheep and its association with lamb mortality［J］.Anim Genet，2006，37：465－468.

［9］Forrest R，Hickford J G H，Frampton CM.Polymorphism at the ovine β3－adrenergic receptor locus（ADRB3）and its association with lamb mortality［J］.J Anim Sci，2007，85：2801-2806.

［10］程俐芬，高晋生.山西省地方羊品种资源现状及存在的问题［C］//中国羊业进展论文集.2008：111-113.

［11］罗惠娣，毛杨毅，张丽，等.山西省六个地方羊品种微卫星位点多态性研究［J］.家畜生态学报，2010，31（1）：17-24.