西门塔尔牛短期重复超排效果与分析

赵 鑫,胡高博,卞江涛,卢全晟,宋彦军,薛 利,王国旗,张居农

(1.石河子大学动物科技学院,新疆 832000;2.北京合众牧丰科技有限公司,北京 100057)

母牛的卵巢在出生时含有20万～40万个卵母细胞,但在其生命过程中有99%的原始卵泡闭锁,仅有1%的可以发育成熟而排卵[1]。应用超数排卵技术可使每次排卵由1～3个增至10～20个,而通过重复超排,可充分发挥良种奶牛的繁殖潜力,对育种和快速扩群具有特别重大的意义。郭志勤等(2001)[2]、张居农等(2005)[3]、呼格吉勒图(2003)[4]、付静涛等(2002)[5]、卢全晟等(2003、2005)[6,8]、马学海(2007)[7]、陈静波(1992)[9]的研究报道认为,采用外源激素重复超排,以非手术冲胚对中国荷斯坦牛、安格斯牛、海福特牛和娟姗母牛的内分泌及生殖道的刺激影响较小,可多次进行重复超排处理。为探讨重复超排在西门塔尔母牛中应用的效果及影响因素,本研究在北京日升德龙奶牛养殖公司牛场进行了试验,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 供体母牛 本试验选择6头年龄4～9岁,健康,有正常的发情周期,无繁殖机能疾病,膘情中上等的西门塔尔经产母牛。母牛分娩60 d以上,断乳,无流产史,性情温顺。直肠检查卵巢机能正常,子宫颈无明显弯曲,子宫角对称。

供试母牛在开放式圈舍按奶牛的饲养管理标准饲喂,计算机控制精确给料,自由饮水。供体牛按饲养管理程序正常饲养,定时饲喂、挤奶,自由运动,每天 3次饲喂,保证充足的微量元素,一次注射维生素A、D、E。

母牛在超排前2个月进入固定胚胎采集与移植场地,单独组群、编号,保持饲养环境相对稳定。试验地为北京日升德龙奶牛养殖公司牛场。

1.2 供试药物与仪器设备 FSH:中国科学院动物研究所纯化冻干产品(7.0～7.5 mg/瓶);FSH(Foiltropin):加拿大Vetrepharm Cananda lnc生产;EAZIBREEDCIDR(1.9 g Progesterone):PfizerPty.Iimited生产;氯前列烯醇(PG,0.2mg):上海市计划生育科学研究所生产;促排卵素3号(LHRH-A3):宁波激素制品有限公司生产;2%利多卡因:泅水希尔康制药有限公司生产;移植枪、塑料硬外套、无菌软外套:法国卡苏公司生产;实体显微镜:日本Olympus公司;CL5500胚胎冷冻仪:澳大利亚Cytologic公司生产;Millipore超纯水仪:英国Whattman公司生产;0.5～10 jxL微量计量器:美国Gilson公司生产;10～18Fr冲卵管:日本富士平公司生产;35～60塑料培养皿:瑞士Nunc公司生产;集卵杯(侧漏式):日本富士平公司生产;集卵杯(侧漏式):法国卡苏公司生产。试验用无机盐试剂除特别说明外,均购自Sigma公司。

1.3 母牛超排处理方案 本试验采用FSH逐次递减法进行超排处理。首先检查供体牛子宫及卵巢的状态,然后按表1的方案进行同期发情与超数排卵进行处理。

在供体牛发情周期任意一天给供体牛埋植CIDR,以埋植CIDR当天为0 d;第5天开始注射FSH,连续4 d减量注射;第7天下午和第8天上午分别注射PG 2支;第8天下午撤栓,同时观察发情。在供体牛接受爬跨后第1次输精,之后约隔12 h第2次输精,输精剂量比正常人工授精多1倍。试验组牛在第1次输精。以发情日计为0 d,在第17天采用非手术法采卵。1个情期后 ,再按上述步骤再次超排同批西门塔尔母牛,对比2次超排的结果。

表1 母牛超排处理方案

1.4 冲胚 本试验采用2种冲胚方法。第1种方法为注射式冲胚,第2种为硬膜外腔麻醉的滴注式冲胚法,操作过程按卢全晟等(2003)[8]方法进行。

1.5 胚胎的采集与鉴定 在供体牛发情配种后的第7天,用采卵管非手术采卵,在连续变倍体视镜下,按形态鉴定标准分为A、B、C三个等级。其中只有A、B级可以冷冻保存,C级胚胎一般用胚胎移植枪移植给受体母牛。A级胚胎形态典型,卵细胞和分裂球的轮廓清晰,细胞质致密,色调和分布极均一。B级胚胎与典型的胚胎相比,稍有变形,但卵细胞和分裂球的轮廓清晰,细胞质致密,分布均一,变性细胞和水疤不超过10%～30%。C级胚胎形态有明显变异,卵细胞和分裂球轮廓稍不清晰或部分不清晰,细胞质不致密,分布不均匀,色调突起的水泡和变性细胞占30%～50%。

本试验中的可用胚胎指的是A级和B级2个等级的胚胎。

1.6 数据处理 分别统计分析连续超排对母牛回收卵、可用胚胎、退化胚胎和未受精比率,统计结果用方差分析和t检验进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 第1次超排结果与分析 由表2可见,4～7岁母牛(07106、07112、07136、07140、07142)超排获得的胚胎数个体间差异不显著(P＞0.05);而4～7岁母牛与9岁母牛(07119)超排获得的胚胎数比较,差异显著(P＜0.05)。

表2 西门塔尔母牛第1次超排结果 枚

2.2 第2次超排结果与分析 间隔30 d,采用同样的超排处理方案,对6头西门塔尔母牛进行了第2次超排处理,结果列于表3。2次超排结果比较见表4。由表4可知耳号为07136和07142牛2次超排胚胎可用率差异显著(P＜0.05),其余 4头(07106、07112、07119、07140)与第 1次超排结果差异不显著(P＞0.05);而在退化胚胎率和未受精率方面,两次超排的结果差异显著(P＜0.05)。本试验发现,西门塔尔母牛反复超排,对胚胎可用率没有显著影响或者影响比较小(表4),但第2次超排后胚胎退化率明显增加,未受精率也升高(P＜0.01)。

本试验还注意到,重复超排后获胚总数略有下降(P＞0.05),说明超排对西门塔尔母牛有一定的影响,造成这种现象的原因可能是:第1次超排后母牛的卵巢增大,黄体过多,虽然经过一个情期短时间的恢复,仍然有部分母牛的卵巢没有完全恢复好。而且同一个体在不同时间对药品反应也会有一定差别,经过重复超排,母牛对药品的敏感度也会降低。

表3 西门塔尔母牛第2次超排结果 枚

2.3 提高西门塔尔牛超数排卵率相关因素的探讨营养状况是影响供体母牛超数排卵的重要因素之一。郭志勤等(2001)[2]认为,中等膘情的供体牛超数排卵处理后可获得理想的排卵数,优于其它膘情的牛。本试验的结果证实了这一点。

本试验采用综合措施以提高采胚率和可用胚率,尽量避免应激因素对反复超排结果的影响,收到较好的效果。如加强输精操作,输精时使用细且精致的输精器外鞘,减少子宫损伤;由输精操作熟练的技术人员输精;最后一次输精后8～12 h用青霉素160万u、链霉素100万u溶液清宫等,这与何光中等(2003)[10]、王洪宝等(2003)[11]、吴亦芳等(2004)[12]、刘俊平等(2008)[13]、李树静等(2001)[14]应用此技术得到的效果是一致的。

表4 西门塔尔母牛2次超排结果比较 %

超排处理本身对母牛是一次应激,而重复超排的母牛必须要有一个时期恢复,这个时间以50～60 d为宜。重复超排间隔时间短,供体的生殖系统与激素调节不能完全恢复,重复超排效果不稳定;间隔时间长,则影响到母牛的利用率。

本试验间隔30 d后对西门塔尔母牛进行重复超排,获得一定的效果。限于条件,本研究仅对同一供体母牛进行了2次的重复超排,而连续多次重复超排的最佳时间间隔、激素处理方案等还有待于进一步探讨。

3 结论

本试验在间隔30 d对6头4～9岁的西门塔尔母牛进行重复超排,第1次超排获得胚胎73枚,可用胚胎49枚;第2次超排获得胚胎69枚,可用胚胎45枚。母牛经过一个情期的生殖与体况的恢复,其卵巢机能恢复到超排前的状态,采用重复超排,生产优质胚胎,可以提高优秀母牛胚胎的生产数量。

[1]郭志勤,张继慈,张沅,等.家畜胚胎工程[M].北京:中国科学技术出版社,1998.

[2]郭志勤.利用CIDR处理供体牛超数排卵的效果[J].草食家畜,2001(增刊).

[3]张居农,王安江.大幅度提高山区牧场母牛胚胎移植成功率的技术探讨[J].中国奶牛,2005(4):34-35.

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[12]吴亦芳,李海洋,徐敬趁,等.荷斯坦奶牛高频率连续超排研究初试[G]//中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会.第十二届全国动物繁殖学术讨论会论文.浙江:宁波,2004:338-339.

[13]刘俊平,刘凤军,王勇胜,等.牛胚胎移植产业化超数排卵的系统研究[J].黑龙江畜牧兽医,2008(2):17.

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